重要的是對(duì)稀釋的稱(chēng)重校正以及比對(duì)一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)二級(jí)標(biāo)準(zhǔn)的許多稀釋度的測(cè)定，要求覆蓋整個(gè)范圍呈線性，并且回歸要通過(guò)零點(diǎn)，根據(jù)回歸線的斜率定值。血清蛋白和載脂蛋白的標(biāo)準(zhǔn)晶（或參比材料）與大多數(shù)其他非純化蛋白的以血清為基礎(chǔ)的標(biāo)準(zhǔn)品不一樣，因此，其可被直接用于對(duì)zui終校準(zhǔn)品的定值。因?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)品以血清為基礎(chǔ)，所以基質(zhì)效應(yīng)上的差異基本上可以排除。
對(duì)于激素和腫瘤標(biāo)志物來(lái)說(shuō)，一級(jí)和二級(jí)標(biāo)準(zhǔn)品通常稀釋于人工含蛋白的緩沖液中，對(duì)所有復(fù)溶和稀釋都應(yīng)進(jìn)行稱(chēng)重校正，并根據(jù)不同稀釋度的回歸線的斜率定值。復(fù)溶后，一級(jí)和校準(zhǔn)的二級(jí)標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)分裝成小包裝，密封于玻璃安瓿中一70℃下保存。二級(jí)標(biāo)準(zhǔn)品通常用低蛋白含量（例如0．5％～1．0％的清蛋白）的緩沖液制備，但校準(zhǔn)品應(yīng)以血清為基質(zhì)或用蛋白含量類(lèi)似于血清的緩沖液制備。這一點(diǎn)對(duì)用來(lái)傳遞值的測(cè)定方法有較嚴(yán)格的要求，即其基本不受基質(zhì)不同的影響?？赏ㄟ^(guò)測(cè)定稀釋于零校準(zhǔn)晶中的樣本來(lái)確證沒(méi)有基質(zhì)效應(yīng)。理想情況下，應(yīng)使用參考方法來(lái)進(jìn)行值的傳遞，但對(duì)于多肽激素和腫瘤標(biāo)志物來(lái)說(shuō)尚無(wú)此類(lèi)方法。用于校準(zhǔn)品制備的無(wú)內(nèi)源性激素的基質(zhì)，可使用已去掉激素的病人血清?？赏ㄟ^(guò)使用特異抗體的免疫吸附方法將多肽激素從血清中去除，但這種方法常會(huì)少量抗體在血清中，這種抗體對(duì)相應(yīng)的免疫測(cè)定方法會(huì)有所干擾。有時(shí)也使用動(dòng)物血清或人工蛋白緩沖液作為制備基質(zhì)，這些基質(zhì)各有其優(yōu)缺點(diǎn)。人血清是zui自然的基質(zhì)，但較難大量得到，使得每批標(biāo)準(zhǔn)品的量有限，需頻繁更換，每批之間總會(huì)有微小差異。動(dòng)物血清雖可大量得到，但其整體上的特性與人血清是不一樣的，并且動(dòng)物激素與人激素可能會(huì)有交叉反應(yīng)。蛋白緩沖液則缺乏正常血清中所具有的大部分干擾物質(zhì)，如果樣本體積相對(duì)總的測(cè)定體積較?。?0％～15％）的話，這些影響通?？梢院雎圆挥?jì)。
對(duì)于類(lèi)固醇激素來(lái)說(shuō)，由于結(jié)合蛋白的干擾，對(duì)結(jié)合蛋白的激素的直接測(cè)定的校準(zhǔn)較為復(fù)雜。因?yàn)榻Y(jié)合蛋白的親和力與所使用的測(cè)定抗體相類(lèi)似，所以在測(cè)定中必須使用分離物質(zhì)以替代離開(kāi)結(jié)合蛋白的激素，很難在不干擾抗體結(jié)合的情況下*排除結(jié)合蛋白的影響。因此，要有以血清為基礎(chǔ)的校準(zhǔn)品。無(wú)類(lèi)固醇的血清可通過(guò)木炭吸附的方式制備，可將溶解在乙醇中的純類(lèi)固醇加入至去除內(nèi)源性類(lèi)固醇的血清中制備校準(zhǔn)品，但仍發(fā)現(xiàn)有異常結(jié)合蛋白可引起較大的偏差，如具有高性激素結(jié)合球蛋白（SHBG）的樣本用于睪酮直接測(cè)定時(shí)結(jié)果偏低，但SHBG稍有異常的樣本，則測(cè)定結(jié)果偏高。除了結(jié)合蛋白，所有影響其他免疫測(cè)定的非特異因素也影響類(lèi)固醇和甲狀腺激素的測(cè)定。為改善方法的測(cè)定下限，樣本在總的測(cè)定體積中的比例很高，因此，存在于樣本中的非特異因素是測(cè)定誤差的重要來(lái)源。對(duì)類(lèi)固醇激素提取方法的校準(zhǔn)非常簡(jiǎn)單，標(biāo)準(zhǔn)品可得到商品純品，將其稱(chēng)量后溶于有機(jī)溶劑（通常為乙醇）可制備校準(zhǔn)品貯備液，類(lèi)固醇的含量可采用光電比色確認(rèn)。稀釋貯備液即可得到校準(zhǔn)晶應(yīng)用液。
標(biāo)準(zhǔn)品定值的測(cè)定方法可使用參考方法。定義方法（definitivemethod）是一個(gè)具有高精密度及沒(méi)有系統(tǒng)偏差的參考方法。放射性核素稀釋質(zhì)量分光光度法（isotope dilution-mass spectrometry，ID-MS）可作為類(lèi)固醇激素和其他一些小分子測(cè)定的定義方法，但這種方法極為昂貴因此難于大規(guī)模使用。用于蛋白測(cè)定的質(zhì)量分光光度法雖在快速發(fā)展，但仍無(wú)合適的方法用于復(fù)雜生物學(xué)樣本中低濃度多肽的定量測(cè)定。當(dāng)沒(méi)有定義方法可使用時(shí)，則可確定一個(gè)參考方法，例如有人提出了載脂蛋白B的參考方法。hCG測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)化工作組推薦了可用于不同hCG變異體測(cè)定的參考方法。這種參考方法應(yīng)有低測(cè)下限、不受非特異干擾及不與相關(guān)的化合物發(fā)生交叉反應(yīng)，同時(shí)還應(yīng)該容易得到。盡管所有關(guān)鍵試劑都相同，但在測(cè)定具體設(shè)計(jì)上的差異仍會(huì)引起偏倚，因此，有必要建立一個(gè)參考實(shí)驗(yàn)室的網(wǎng)絡(luò)，以保持參考方法的有效性。
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