用慢病毒篩選穩(wěn)定細胞株,以G418篩選方法為例,篩選出穩(wěn)定整合Neomycin抗性基因的細胞系.
A、 G418抗生素*濃度篩選
每種細胞對抗生素的敏感性不同,因此,準備建立穩(wěn)定細胞系之前,需要確定能夠在10-14天殺死細胞的*濃度.
方法如下：
1、將細胞稀釋到1000個細胞/mL,接種到24孔板,每孔1ml.
2、接種后第二天在100ug/mL~1mg/mL的G418濃度范圍內進行篩選.3、每隔3天跟換1次培養(yǎng)液,保持G418濃度不變.
4、選擇出在10~14天內使細胞全部死亡的zui低G418濃度來進行下一步的篩選試驗.由于每種細胞對G418的敏感性不同,一般變動在100ug/ml～1000ug/ml范圍.
B. 慢病毒感染細胞和穩(wěn)定細胞系篩選
1、在6孔板培養(yǎng)皿內種植約5×10^4細胞CO2 孵箱培養(yǎng)24小時.
2、準備 3ml 培養(yǎng)基,加入Polybrene,終濃度為6-8 μg/ ml.將制備好的適量病毒顆粒加至上述培養(yǎng)基,輕吹混勻.去除舊的培養(yǎng)基,加入含病毒培養(yǎng)基.
3、病毒感染后 24小時,用新鮮的*培養(yǎng)基替換含有病毒的培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)48小時.
4、換用含*濃度G418 的培養(yǎng)基.根據(jù)細胞敏感性不同,以后每隔3-5天換用新鮮的含有G418的培養(yǎng)基,以替換含大量死細胞的培養(yǎng)基.待抗性細胞長滿以后,細胞轉入10cm 培養(yǎng)皿,同時,留一部分細胞在原來的60mm 平皿內,待細胞長滿后,收獲細胞,在蛋白或mRNA 水平鑒定基因過表達或敲低效率.
Polybrene 配制：用 0.9%的NaCl 溶解Polybrene 干粉（濃度為10 mg/ml）,高壓滅菌,可以在4 ℃穩(wěn)定存放1 年,也可凍存于-20℃.干粉可以在4 ℃ 穩(wěn)定存放數(shù)年.
G418的配制： 取1g G418溶于1ml 1M的HEPES液中,加蒸餾水至10ml,過濾消毒,4度保存.
