如前所述，Northern印跡雜交不能直接反映mRNA轉(zhuǎn)錄效率，而需作進(jìn)行中的核轉(zhuǎn)錄分析（nuclearrunOntranscriptionassay）。
mRNA轉(zhuǎn)錄在細(xì)胞核內(nèi)進(jìn)行，因此首先需分離細(xì)胞核，讓細(xì)胞核內(nèi)原已開始的mRNA轉(zhuǎn)錄在體外合適的反應(yīng)條件下繼續(xù)進(jìn)行，并同時(shí)攝取[32p]—UTP，從而將一定時(shí)間內(nèi)體外轉(zhuǎn)錄的mRNA標(biāo)記；然后提取核RNA，與已轉(zhuǎn)移到尼龍膜上的、同待檢mRNA互補(bǔ)的cDNA雜交。如某一mRNA轉(zhuǎn)錄活性加強(qiáng)，則該RNA標(biāo)記也增加，特異雜交體亦相應(yīng)增多，它可直接反映單位時(shí)間內(nèi)特定mRNA的轉(zhuǎn)錄量。此法可同時(shí)分析多種基因的轉(zhuǎn)錄活性。
1．材料
（1）胞膜裂解液：10mmol／LTris／HCl（pⅢ．5）含10mmol NaCl，3retool MgCla，0．4％NP-40（WV）及l(fā)mmolDTl7。
（2）反應(yīng)緩沖液：20mmol／LTris／HCl，pH8．0含5mmol MgCl2，140mmol KCl，1mmol DTF，0．1mmolEDTA及20％甘油。
（3）雜交液：50％甲酰胺，4×SSC，5×Denhardts液，0．1％SDS，18nunol／L磷酸鹽緩沖液pH7．0，100,ug／mL變性鮭精DNA。
（4）50×Denhardts液，1％BSA，1％Ficoll，1％聚乙烯吡咯烷酮（PVP）。
2．操作步驟
（1）將細(xì)胞用冷PBS洗一次，離心后，將細(xì)胞懸浮于胞膜裂解液中，置冰上5min，經(jīng)過(guò)此處理，可將細(xì)胞膜裂解，而細(xì)胞核則保持完整。
（2）將細(xì)胞核用反應(yīng)緩沖液洗一次，再于300~L反應(yīng)緩沖液（已加Immol／LATP、CTP、GTP及200t~Ci[32p）—UTP）中，37~C孵育30rain。
（3）加入異硫氰酸胍終止反應(yīng)，按RNA一步提取法（見第十九章）提取RNA，在乙醇沉淀過(guò)程中可將游離[32p]—UTP與摻人到RNA中的[32p]—UTI分離開。
（4）用p-射線計(jì)數(shù)儀測(cè)定各樣品放射活性，并將各樣品放射活性調(diào)整成一致。
（5）將特定eDNA通過(guò)Slotblot或Dotblot（詳見第十九章）轉(zhuǎn)移到NC膜或尼龍膜上。
（6）將膜放于雜交液中，于45~C預(yù)雜交4h。
（7）將標(biāo)記核RNA于70~C變性5min，加入雜交液中（放射活性至少為107cpm／mL），45~C雜交48h。
（8）將膜于室溫下用2× SSC／0．2％SDS洗3次，每次30min，然后于60~C用0.1×SSC／0．1％SDS洗2次，每次30min。
（9）在膜上壓X光片，于—70~C曝光過(guò)夜或數(shù)天，顯影、定影后，觀察結(jié)果。
（10）放射自顯影片也可作密度掃描，對(duì)結(jié)果進(jìn)行半定量測(cè)定。
3．注意事項(xiàng) 胞膜裂解液中NP-40的濃度應(yīng)根據(jù)所使用的細(xì)胞種類不同而異，先作預(yù)試，使用濃度以剛好破壞細(xì)胞膜而不損害核膜為合適。
會(huì)員1.png)