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上海拜力生物科技有限公司

在蛋白質(zhì)印跡中使用二抗的一般建議

時(shí)間:2011-12-5閱讀:1073

在Western blots中使用二抗的一般建議

1. 控制

在 為了區(qū)分樣品的特定和非特異性條帶 材料,始終對(duì)每個(gè)印跡運(yùn)行對(duì)照,其中只有二次 應(yīng)用不含一抗的抗體偶聯(lián)物。

2.二抗稀釋

這 二抗不應(yīng)在過(guò)高濃度下使用。在 大多數(shù)應(yīng)用中二抗可以很好地用于稀釋 高于 1:10.00,而較高濃度可能有利于非特異性 后臺(tái)綁定。作為指導(dǎo)原則,與彩色承印物相比 當(dāng)ECL底物 使用。最佳稀釋度也可能因不同批次的 二抗。

Western blotting的推薦稀釋度

 • HRPO conjugates1:5.000 – 1:100.000 (non-ECL) / 1:10.000 – 1:200.000 (ECL)

• Alk. Phos. conjugates1:5.000 – 1:50.000

• Biotin conjugates1:20.000 – 1:400.000

 • Streptavidin-HRPO0,01 – 0,1 µg/ml

•  Streptavidin-Alk.Phos1 – 2 µg/ml

3.使用牛奶粉時(shí)的注意事項(xiàng)

牛 奶粉經(jīng)常用作Western blotting中的封閉劑, 但有時(shí)它也可能是不需要的背景的來(lái)源。在 為了減少二抗的背景反應(yīng) 牛Ig在奶粉中利用二抗吸附 對(duì)牛(MinX Bo)或人類(MinX Hu)Ig/血清蛋白是 推薦。

減少非特異性背景的其他措施包括用來(lái)自與二抗相同物種的 5% 正常血清或不含 IgG 的 BSA(貨號(hào) 001-000-161 / 2)進(jìn)行封閉。通常,改用正常血清作為封閉試劑可有效獲得最干凈的印跡結(jié)果。

一般來(lái)說(shuō),次要的 抗體應(yīng)在不含蛋白質(zhì)堿(如牛奶)的緩沖液中稀釋 粉末A.O.為了排除二抗與 蛋白質(zhì)補(bǔ)充劑中存在的免疫球蛋白或蛋白質(zhì)。這是 對(duì)于抗山羊偶聯(lián)物尤其重要(見(jiàn)4)。

4. 使用抗山羊偶聯(lián)物時(shí)的注意事項(xiàng)

防山羊 來(lái)自宿主物種驢、兔和小鼠的二抗 與牛免疫球蛋白高度交叉反應(yīng),例如牛奶中的免疫球蛋白 粉。如果二抗稀釋緩沖液含有奶粉, 幾乎所有的反山羊偶聯(lián)物都會(huì)被牛Ig吸附。 這會(huì)導(dǎo)致信號(hào)Wan全缺失或信號(hào)微弱,如果 共軛物以高濃度施用。此外,這些 如果牛奶粉 用于阻止。

為了檢測(cè)蛋白質(zhì)印跡上的山羊一抗,我們建議使用??股窖颍ㄘ浱?hào)805-xx5-180)。在非常密切相關(guān)的宿主牛中產(chǎn)生抗山羊抗血清導(dǎo)致抗體與牛Ig /血清蛋白沒(méi)有交叉反應(yīng)性。

5. 樣品裂解物中的內(nèi)源性免疫球蛋白

如果 由SDS-PAGE分離的樣品材料是 含免疫球蛋白的細(xì)胞或組織,無(wú)二抗 與樣品相同的物質(zhì)的交叉反應(yīng)(MinX)應(yīng)該是 使用。(或者,正常血清(Ig)的相同物種比 樣品材料可以添加到二抗稀釋緩沖液中。

6. 免疫沉淀后抗體的背景條帶

在 下面的文章你可以閱讀背景波段是如何引起的 使用時(shí)可避免在印跡膜上沉淀免疫球蛋白 用于蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)的二抗。


免疫印跡(蛋白質(zhì)印跡) – 避免抗體的背景條帶

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一 免疫印跡(蛋白質(zhì)印跡)最Chang用的問(wèn)題 用于間接檢測(cè)的二抗是背景條帶引起的 通過(guò)樣品制備中的抗體來(lái)源于例如 免疫沉淀,裂解物中的細(xì)胞或組織自身免疫球蛋白或 牛免疫球蛋白污染(細(xì)胞裂解物中的FCS,BSA, 等)。從樣品中開槽的抗體重鏈和輕鏈之后 分別在 50 kDa 和 25 kDa 下減小 SDS-PAGE 顯示帶。 在非還原條件下,γ 免疫球蛋白 (IgG) 顯示 約150 kDa。

Antibody_light_chain_in_WB_13bb05340b

在免疫沉淀(IP)中,關(guān)注這個(gè)問(wèn)題是最重要的;特別是在免疫沉淀之后,當(dāng)目標(biāo)蛋白預(yù)計(jì)在25kDa或50kDa范圍內(nèi)時(shí),必須解決這個(gè)問(wèn)題。

這 IP后抗體背景帶問(wèn)題Wan全可以 通過(guò)使用直接偶聯(lián)的一抗來(lái)旁路 檢測(cè)目標(biāo)蛋白。然而,標(biāo)記的一抗是 通常不可用,因此必須檢測(cè)未共軛的原發(fā)性 與二抗偶聯(lián)物。

一 防止抗體在印跡后被印跡的可能方法 免疫沉淀包括與蛋白 A/G 包被的交聯(lián)抗體 磁珠或共價(jià)偶聯(lián)抗體直接與處理過(guò)的磁珠。 然而,為了避免使用這種方法的抗體污染, 在非變性條件下洗脫抗原至關(guān)重要,因?yàn)?否則,變性抗體片段將用 抗原。

如果抗原上 使用非偶聯(lián)的一抗和 標(biāo)記的二抗,可以通過(guò)選擇 某些要求下右二抗:

用于免疫沉淀和印跡檢測(cè)的一抗:

1.來(lái)自不同的寄主物種。

背景 印跡膜上沉淀抗體的條帶可通過(guò)以下方式避免 對(duì)物種無(wú)交叉反應(yīng)(MinX)的二抗 沉淀抗體。

示例:用多克隆兔抗靶蛋白沉淀,用單克隆小鼠抗靶蛋白
檢測(cè)印跡>二抗抗小鼠IgG(H + L)MinX兔等。(例如,第 115-035-146 類)。

蛋白質(zhì)印跡無(wú)種間交叉反應(yīng)的抗 IgG/M (H+L) 列表 在以下位置查找更多用于蛋白質(zhì)印跡的抗 Ig(H+L) 特異性抗體: 二抗

2. 來(lái)自同一宿主物種,并且

a.具有不同的同種型。

由 選擇針對(duì) 一抗抗體的子/類 識(shí)別 可以避免印跡膜上沉淀抗體。
示例: 用單克隆小鼠(IgG1)抗靶蛋白沉淀, 用單克隆小鼠 (IgG2a) 抗靶蛋白
>二抗抗小鼠 IgG2a(例如貨號(hào) 115-035-206)檢測(cè)印跡。

用于蛋白質(zhì)印跡的抗 IgG 亞類和抗 IgM 特異性二抗列表

b.目標(biāo)蛋白接近50 kDa。

針對(duì)小鼠IgG輕鏈的二抗不與小鼠IgG輕鏈(50kDa)的還原和變性重鏈(50kDa)反應(yīng) 沉淀抗體。它們只與還原的變性光結(jié)合 沉淀抗體的鏈在印跡上(見(jiàn)圖)和 用于檢測(cè)的一抗的天然輕鏈。 因此,可以在沒(méi)有 來(lái)自誘發(fā)抗體的干擾。只有一個(gè)抗體條帶 輕鏈區(qū)域,但不在目標(biāo)范圍內(nèi) 檢測(cè)到蛋白質(zhì)。

示例: 目標(biāo)蛋白約50 kDa;使用單克隆小鼠沉淀 (IgG1)抗靶蛋白,用單克隆小鼠印跡檢測(cè) (IgG1) 抗靶蛋白
> 二抗抗小鼠 Ig/G 輕鏈(例如貨號(hào) 115-035-174)。

c.目標(biāo)蛋白接近25kDa。

針對(duì)小鼠IgG的Fc片段的二抗與 沉淀抗體。它們只與減少的、變性的重物結(jié)合 印跡和重鏈上的沉淀抗體鏈和重鏈 用于檢測(cè)的天然一抗。因此,25 kDa 可以在印跡膜上檢測(cè)蛋白質(zhì),而不會(huì)受到 沉淀抗體。只有一個(gè)抗體條帶在 重鏈,但不在目標(biāo)蛋白質(zhì)的范圍內(nèi)被標(biāo)記。

示例:目標(biāo)蛋白約 25 kDa;使用單克隆小鼠(IgG1)抗靶蛋白沉淀,用單克隆小鼠(IgG1)抗靶蛋白
>二抗抗小鼠IgG Fc(例如貨號(hào)115-035-071)檢測(cè)印跡。
用于蛋白質(zhì)印跡的抗IgG Fc特異性二抗列表

注意:如果一抗在未還原的 形式以及目標(biāo)蛋白是否與其大小等相關(guān)??梢燥@示 在SDS-PAGE中,可以在不減少試劑的情況下應(yīng)用樣品。 用于沉淀的一抗僅形成一種抗體 150 kDa的波段,不會(huì)干擾目標(biāo)檢測(cè) 超出此分子量范圍的蛋白質(zhì)。

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