人N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶（NAG）ELISA試劑盒說明書

人N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶（NAG）ELISA試劑盒僅供研究使用

檢測范圍：0.533 mIU/ml-40 mIU/ml

zui低檢測限：0.03 mIU/ml

預(yù)期應(yīng)用：ELISA法定量測定人血清，血漿及其它相關(guān)生物液體中NAG含量。

說明:

1.剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會含有少許水樣物質(zhì)，此為正?，F(xiàn)象，不會對實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成任何影響。 

2.濃洗滌液低溫保存會有鹽析出，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶。 

實(shí)驗(yàn)原理:采用競爭酶聯(lián)免疫法法檢測NAG含量。首先用一株單抗體包被微孔板，制備成固相抗體，然后加入待測標(biāo)本或標(biāo)準(zhǔn)品，以及辣根過氧化物酶標(biāo)記的NAG，使之形成包被抗體- -NAG（HRP）復(fù)合物。經(jīng)顯色后在酶標(biāo)儀測定吸光值（OD值），通過計(jì)算機(jī)或作圖擬合濃度-吸光度曲線，反算出待測標(biāo)本中NAG含量。

人N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶（NAG）ELISA試劑盒組成及試劑配制:

1.酶聯(lián)板（Assay plate ）:一塊（96孔）。 

2.標(biāo)準(zhǔn)品（Standard）:5×0.5 ml/瓶。

Standard S1 S2 S3 S 4 S 5

Concentration （mIU/ml） 0.533 1.067 2.67 10.67 40

3.酶結(jié)合物（HRP-conjugate）:1×6ml/瓶。

4.顯色劑A（Substrate A）:1×7ml/瓶。

5.顯色劑B（Substrate B）:1×7ml/瓶。

6.濃洗滌液（Wash Buffer）:1×15ml/瓶，使用時(shí)每瓶用蒸餾水稀釋20倍。 

7.終止液（Stop Solution）:1×7ml/瓶

需要而未提供的試劑和器材:

1.標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格酶標(biāo)儀

2.高速離心機(jī)

3.電熱恒溫培養(yǎng)箱

4.干凈的試管和Eppendof管

5.系列可調(diào)節(jié)移液器及吸頭，一次檢測樣品較多時(shí)，用多通道移液器

6 蒸餾水，容量瓶等

標(biāo)本的采集及保存:

1.血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

2.血清：全血標(biāo)本請于室溫放置2小時(shí)或4℃過夜后于1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

注：以上標(biāo)本置4℃保存應(yīng)小于1周，-20℃或-80℃均應(yīng)密封保存，-20℃不應(yīng)超過1個(gè)月，-80℃不應(yīng)超過2個(gè)月；標(biāo)本溶血會影響zui后檢測結(jié)果，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測。

操作步驟：

1.將各種試劑至室溫〔18-25℃〕平衡半小時(shí)，取濃縮洗滌液，根據(jù)當(dāng)批檢測數(shù)量，用蒸餾水1：20稀釋，混勻后備用。

2.將酶標(biāo)板取出，設(shè)一個(gè)空白對照孔、不加任何液體；每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)依次各設(shè)兩孔，每孔加入相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品50ul；其余每個(gè)檢測孔直接加待測標(biāo)本50ul。 

3.每孔加入酶結(jié)合物50ul（空白對照孔除外），充分混勻，貼上不干膠封片，置37℃溫育1小時(shí)。

4.手工洗板，棄去孔內(nèi)液體。洗滌液注滿各孔，靜置10秒甩干，重復(fù)三次后拍干；洗板機(jī)洗板，選擇洗滌三次程序，洗板后拍干。

5.每孔加顯色劑A液50μl，顯色劑B液50μl，振蕩混勻后，37℃避光顯色15分鐘，每孔加終止液50μl。

6.用酶標(biāo)儀讀數(shù)，取波長450nm，先用空白孔調(diào)零點(diǎn)，然后測定各孔OD值。

數(shù)據(jù)處理:

1.計(jì)算機(jī):使用線性擬合功能,應(yīng)將標(biāo)準(zhǔn)品S1-S5的濃度取對數(shù)（Log（濃度））作為X,將對應(yīng)的OD值減去空白對照孔OD值后取對數(shù)（Log（OD值-NSB））作為Y,進(jìn)行線性擬合。再從擬合線上計(jì)算出待測血清濃度。

2.手工作圖：用雙對數(shù)坐標(biāo)紙，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫軸，以對應(yīng)的0D值為縱軸，畫出平滑曲線或直線，在曲線上按照待測血清OD值找到對應(yīng)的濃度值。

注意事項(xiàng):

1.從冷藏環(huán)境中取出的試劑盒內(nèi)全部瓶裝試劑及所需預(yù)包被板條應(yīng)置室溫（18-25℃）平衡30分鐘后方可使用，余者應(yīng)及時(shí)封好口，放回2-8℃中避光保存，以備后用。

2.使用前試劑應(yīng)搖勻。

3.結(jié)果判斷須在反應(yīng)終止后10分鐘內(nèi)完成。

4.不同批號的試劑不可混用。

5.加樣時(shí)應(yīng)注意避免所用各試劑及樣品之間的交又污染。

6.操作時(shí)，試劑盒內(nèi)每種試劑各使用一個(gè)吸頭，每一種標(biāo)準(zhǔn)品使用一個(gè)吸頭，每一個(gè)樣品各使用一個(gè)吸頭，吸頭一次性使用。

特異性：本試劑盒可同時(shí)檢測天然或重組的NAG，且與其他相關(guān)蛋白基本無交叉反應(yīng)。

有效期：6個(gè)月（2-8℃避光保存）