1  范圍

    本標準規(guī)定了食品中霉菌和酵母（moulds and yeasts）的計數(shù)方法。

    本標準適用于各類食品中霉菌和酵母的計數(shù)。

2  設備和材料

除微生物實驗室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設備外，其他設備和材料如下：

2.1  培養(yǎng)箱：28 ℃±1 ℃。

2.2  拍擊式均質器及均質袋。

2.3  電子天平：感量0.1 g。

2.4  無菌錐形瓶：容量500 mL。

2.5  無菌吸管：1 mL(具0.01 mL刻度)、10 mL(具0.1 mL刻度)。

2.6  無菌試管: 18 mm×180 mm。

2.7  旋渦混合儀。

2.8  無菌平皿：直徑90 mm。

2.9  恒溫水浴箱：46 ℃±1 ℃。

2.10  顯微鏡：10×。

3  培養(yǎng)基和試劑

3.1  生理鹽水：見附錄A中A.1。

3.2  馬鈴薯葡萄糖瓊脂：見附錄A中A.2。

3.3  孟加拉紅瓊脂：見附錄A中A.3。

4  檢驗程序

5  操作步驟

5.1  樣品的稀釋

5.1.1  固體和半固體樣品：稱取25 g樣品，加入225 mL無菌稀釋液（水或生理鹽水），充分振搖，或用拍擊式均質器拍打2 min，制成1:10的樣品勻液。

5.1.2  液體樣品：以無菌吸管吸取25 mL樣品至盛有225 mL無菌稀釋液（水或生理鹽水）的錐形瓶（可在瓶內(nèi)預置適當數(shù)量的無菌玻璃珠）或無菌均質袋中，充分振搖或用拍擊式均質器拍打2 min，制成1:10的樣品勻液。

5.1.3  取1 mL 1:10樣品勻液注入含有9 mL無菌稀釋液的試管中，另換一支1 mL無菌吸管反復吹吸，或在旋渦混合儀上混勻，此液為1:100的樣品勻液。

5.1.4  按5.1.3操作程序，制備10倍遞增系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋一次，換用1支1 mL無菌吸管。

5.1.5  根據(jù)對樣品污染狀況的估計，選擇2個～3個適宜稀釋度的樣品勻液（液體樣品可包括原液），在進行10倍遞增稀釋的同時，每個稀釋度分別吸取1 mL樣品勻液于2個無菌平皿內(nèi)。同時分別取1 mL無菌稀釋液加入2個無菌平皿作空白對照。

5.1.6  及時將20 mL～25 mL冷卻至46 ℃的馬鈴薯葡萄糖瓊脂或孟加拉紅瓊脂（可放置于46 ℃±1 ℃恒溫水浴箱中保溫）傾注平皿，并轉動平皿使其混合均勻。置水平臺面待培養(yǎng)基*凝固。

5.2  培養(yǎng)

瓊脂凝固后，正置平板，置28 ℃±1 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察并記錄，培養(yǎng)至第5 d的結果。

5.3  菌落計數(shù)

用肉眼觀察，必要時可用放大鏡或低倍鏡，記錄稀釋倍數(shù)和相應的霉菌和酵母菌落數(shù)。以菌落形成單位（colony-forming units，CFU）表示。

選取菌落數(shù)在10 CFU～150 CFU的平板，根據(jù)菌落形態(tài)分別計數(shù)霉菌和酵母。霉菌蔓延生長覆蓋整個平板的可記錄為菌落蔓延。

6  結果與報告

6.1  結果

6.1.1　計算同一稀釋度的兩個平板菌落數(shù)的平均值，再將平均值乘以相應稀釋倍數(shù)。

6.1.2　若有兩個稀釋度平板上菌落數(shù)均在10 CFU～150 CFU之間，則按照GB 4789.2的相應規(guī)定進行計算。

6.1.3  若所有平板上菌落數(shù)均大于150 CFU，則對稀釋度zui高的平板進行計數(shù)，其他平板可記錄為多不可計，結果按平均菌落數(shù)乘以zui高稀釋倍數(shù)計算。

6.1.4  若所有平板上菌落數(shù)均小于10 CFU，則應按稀釋度zui低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計算。

6.1.5  若所有稀釋度（包括液體樣品原液）平板均無菌落生長，則以小于1乘以zui低稀釋倍數(shù)計算。

6.2  報告

6.2.1  菌落數(shù)按“四舍五入”原則修約。菌落數(shù)在10以內(nèi)時，采用一位有效數(shù)字報告；菌落數(shù)在10～100之間時，采用兩位有效數(shù)字報告。

6.2.2  菌落數(shù)大于或等于100時，前第3位數(shù)字采用“四舍五入”原則修約后，取前2位數(shù)字，后面用0代替位數(shù)來表示結果；也可用10的指數(shù)形式來表示，此時也按“四舍五入”原則修約，采用兩位有效數(shù)字。

6.2.3　若空白對照平板上有菌落出現(xiàn)，則此次檢測結果無效。

6.2.4  稱重取樣以CFU/g為單位報告，體積取樣以CFU/mL為單位報告，報告或分別報告霉菌和/或酵母數(shù)。

附  錄A

培養(yǎng)基和試劑

A.1  生理鹽水

A.1.1  成分

      氯化鈉                            8.5 g

      蒸餾水                           1 000 mL

A.1.2  制法

    氯化鈉加入1000 mL蒸餾水中，攪拌至*溶解，分裝后，121 ℃滅菌20 min，備用。

A.2  馬鈴薯葡萄糖瓊脂

A.2.1  成分

      馬鈴薯(去皮切塊)                  300 g

      葡萄糖                           20.0 g

      瓊脂                             20.0 g

      *                            0.1 g

      蒸餾水                           1 000 mL

A.2.2  制法

    將馬鈴薯去皮切塊，加1000 mL蒸餾水，煮沸10 min～20 min。用紗布過濾，補加蒸餾水至1000 mL。加入葡萄糖和瓊脂，加熱溶解，分裝后，121 ℃滅菌20 min，備用。

A.3  孟加拉紅瓊脂

A.3.1  成分

      蛋白胨                            5.0 g 

      葡萄糖                            10.0 g

      磷酸二氫鉀                        1.0 g

      *（無水）                    0.5 g

      瓊脂                              20.0 g

      孟加拉紅                          0.033 g

      *                            0.1 g

蒸餾水                            1 000 mL

A.3.2  制法

上述各成分加入蒸餾水中，加熱溶解，補足蒸餾水至1 000 mL，分裝后，121℃滅菌20 min，避光保存?zhèn)溆谩?/p>

附  錄B

霉菌直接鏡檢計數(shù)法

    常用的為郝氏（Howard）霉菌計測法，本方法適用于番茄醬罐頭、番茄汁。

B.1  設備和材料

B.1.1  折光儀。

B.1.2  顯微鏡。

B.1.3  郝氏計測玻片：具有標準計測室的特制玻片。

B.1.4  蓋玻片。

B.1.5  測微器：具標準刻度的玻片。

B.2  操作步驟

B.2.1  檢樣的制備：取定量檢樣，加蒸餾水稀釋至折光指數(shù)為1.3447～1.3460（即濃度為7.9%～8.8%），備用。

B.2.2  顯微鏡標準視野的校正：將顯微鏡按放大率90～125倍調(diào)節(jié)標準視野，使其直徑為1.382mm。

B.2.3  涂片：洗凈郝氏計測玻片，將制好的標準液，用玻璃棒均勻的攤布于計測室，加蓋玻片，以備觀察。

B.2.4  觀測：將制好之載玻片置于顯微鏡標準視野下進行觀測。一般每一檢樣每人觀察50個視野。同一檢樣應由兩人進行觀察。

B.2.5  結果與計算：在標準視野下，發(fā)現(xiàn)有霉菌菌絲其長度超過標準視野（1.382 mm）的1/6或三根菌絲總長度超過標準視野的1/6（即測微器的一格）時即記錄為陽性（＋），否則記錄為陰性（－）。

B.2.6  報告：報告每100個視野中全部陽性視野數(shù)為霉菌的視野百分數(shù)（視野％）。