真菌/酵母細(xì)胞β1，3- D-葡聚糖合成酶活性定量檢測(cè)試劑盒

產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)（中文版）

主要用途

   真菌/酵母細(xì)胞β1，3- D-葡聚糖合成酶活性定量檢測(cè)試劑是一種旨在通過(guò)β1，3- D-葡聚糖合成酶反應(yīng)系統(tǒng)中尿嘧啶核苷-5’-二磷酸葡萄糖底物聚合成葡聚糖，與熒光染料結(jié)合產(chǎn)生熒光峰值的變化，來(lái)測(cè)定樣品中酶活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)由大師級(jí)科學(xué)家精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種真菌或酵母細(xì)胞株裂解懸液中β1，3- D-葡聚糖合成酶的活性檢測(cè)。產(chǎn)品嚴(yán)格無(wú)菌，即到即用，操作簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定，具有高通量特點(diǎn)。

技術(shù)背景

   真菌/酵母細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)具有豐富的糖蛋白外層和碳水化合物內(nèi)層，包括（1,3）-β-D，（1,6）-β-D和（1,3）-α-D-葡聚糖（glucan）。其中（1,3）-β-D為主要元素。1,3-β-D-葡聚糖合成酶（1,3-β-D-glucan synthase；GS；EC.2.4.1.34），又稱為尿嘧啶核苷-5’-二磷酸葡萄糖：1,3-β-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（UDP-glucose：1,3-β-glucosyl transferase），催化以尿嘧啶核苷-5’-二磷酸葡萄糖（UDP-glucose）為底物，通過(guò)1,3-β鏈接聚合為葡聚糖的反應(yīng)，構(gòu)成真菌/酵母細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)中主要碳水化合物成分1,3-β-D-葡聚糖，為細(xì)胞生長(zhǎng)所必需。1,3-β-D-葡聚糖合成酶具有兩種結(jié)構(gòu)體：1個(gè)調(diào)節(jié)亞體，GTPase Rho1p和4個(gè)催化亞體，Bgs1p－4p或Fksp。（1,3）-β-D-葡聚糖合成酶成為抗真菌藥物，例如卡泊芬凈（caspofungi）等的靶標(biāo)?；诘孜颱DP-glucose在葡聚糖合成酶的催化下，聚合成（1,3）-β-D－葡聚糖產(chǎn)物，與苯胺藍(lán)（Aniline blue；4,4-（carbonyl-bis（benzene-4,1- diyl）-bis-（imino）-bis-benzenesulfonic acid）反應(yīng)產(chǎn)生復(fù)合物，呈現(xiàn)熒光峰值的變化（激發(fā)波長(zhǎng)400nm，散發(fā)波長(zhǎng)460nm），由此定量測(cè)定β1，3- D-葡聚糖合成酶的活性。

產(chǎn)品內(nèi)容

保存方式

保存在－20℃冰箱里；反應(yīng)液（Reagent F）避免光照；終止液（Reagent E）具有腐蝕性，注意操作安全；有效保證6月

用戶自備

15 毫升錐形離心管：用于真菌/酵母細(xì)胞收集的容器

1.5 毫升離心管：用于真菌/酵母細(xì)胞裂解操作或反應(yīng)液配制的容器

臺(tái)式離心機(jī)：用于沉淀真菌/酵母細(xì)胞

微型臺(tái)式離心機(jī)：用于真菌/酵母細(xì)胞裂解懸液澄清

超速離心機(jī)：用于微粒體樣品制備

恒溫培養(yǎng)箱或恒溫水槽：用于反應(yīng)孵育

比色皿或酶標(biāo)板：用于染色后熒光檢測(cè)的容器

熒光分光光度儀或熒光酶標(biāo)儀：用于熒光分析

實(shí)驗(yàn)步驟

一、 樣品準(zhǔn)備

1． 準(zhǔn)備好10 毫升待測(cè)的新鮮真菌/酵母細(xì)胞（OD600＝0.4 至0.8，即1 至2 X 107細(xì)胞/毫升）

2． 移入到預(yù)冷的15 毫升錐形離心管

3． 置于冰槽里5 分鐘

4． 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心10 分鐘，速度為3000g

5． 小心抽去上清液

6． 加入xx 微升裂解液（Reagent A），充分混勻

7． 轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5 毫升離心管

8． 加入xx 微升強(qiáng)化液（Reagent B）（注意：參見(jiàn)注意事項(xiàng)3）

9． 強(qiáng)力渦旋震蕩15 秒

10．置于冰槽里1 分鐘

11．重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟9 至10 五次

12．加入xx 微升裂解液（Reagent A），充分混勻

13．放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心10 分鐘，速度為1000g（或3500RPM，例如eppendorf 5415）

14．小心移取500 微升上清液到新的預(yù)冷的1.5 毫升離心管

15．（選擇步驟）如果使用微粒體樣品，放進(jìn)4℃超速離心機(jī)離心60 分鐘，速度為100000g

16．（選擇步驟）小心移取500 微升上清液到新的預(yù)冷的1.5 毫升離心管

17．移取 5 微升進(jìn)行蛋白定量測(cè)定（注意：建議使用 Bradford 蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－ ）

18．即刻放進(jìn)－70℃保存或置 于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作

二、 測(cè)定準(zhǔn)備

1． 準(zhǔn)備好待測(cè)樣品（例如細(xì)胞裂解萃取液或微粒體樣品等），置于冰槽里

2． 設(shè)定好熒光分光光度儀或熒光酶標(biāo)儀（溫度為25℃）：激發(fā)波長(zhǎng)400nm，散發(fā)波長(zhǎng)460nm，并置零

3． 準(zhǔn)備好5 個(gè)1.5 毫升離心管，標(biāo)記為1 至5 號(hào)管

4． 分別加入xx 微升稀釋液（Reagent G）到2 至5 號(hào)管

5． 移取xx 微升標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent H）到1 號(hào)管，混勻

6． 小心移取xx 微升1 號(hào)管稀釋的標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent H）到2 號(hào)管，混勻

7． 小心移取xx 微升2 號(hào)管稀釋的標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent H）到3 號(hào)管，混勻

8． 小心移取20微升3號(hào)管稀釋的標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent H）到4號(hào)管，混勻

9． 將1至5號(hào)管置于室溫下備用；標(biāo)準(zhǔn)管濃度見(jiàn)下表

三、 標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定

1． 移取xx微升緩沖液（Reagent C）到1.5毫升離心管

2． 加入5微升上述配制的標(biāo)準(zhǔn)液

3． 加入xx微升終止液（Reagent E）

4． 放進(jìn)80℃恒溫培養(yǎng)箱或恒溫水槽孵育30分鐘，避免干枯

5． 加入xx微升反應(yīng)液（Reagent F），混勻

6． 放進(jìn)50℃恒溫培養(yǎng)箱或恒溫水槽孵育30分鐘，避免光照

7． 室溫下孵育30分鐘，避免光照

8． 轉(zhuǎn)移到比色皿或酶標(biāo)板

9． 即刻放進(jìn)熒光分光光度儀檢測(cè)：獲得相對(duì)熒光讀數(shù)

10．重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟1至9四次

11．構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線：縱座標(biāo)（Y軸）為相對(duì)熒光單位；橫座標(biāo)（X軸）為標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖濃度（納摩爾/升）

四、 樣品測(cè)定

1． 移取xx微升緩沖液（Reagent C）到1.5毫升離心管

2． 加入xx微升底物液（Reagent D）

3． 加入xx微升上述制備的待測(cè)樣品（20微克微粒體蛋白或100微克細(xì)胞裂解萃取液蛋白），混勻（注意：樣品須清澈）

4． 室溫下（25℃）孵育30分鐘

5． 加入xx微升終止液（Reagent E）

6． 放進(jìn)80℃恒溫培養(yǎng)箱或恒溫水槽孵育30分鐘，避免干枯

7． 加入xx微升反應(yīng)液（Reagent F），混勻

8． 放進(jìn)50℃恒溫培養(yǎng)箱或恒溫水槽孵育30分鐘，避免光照

9． 室溫下孵育30分鐘，避免光照

10．轉(zhuǎn)移到比色皿或酶標(biāo)板

11．即刻放進(jìn)熒光分光光度儀檢測(cè)：獲得樣品相對(duì)熒光讀數(shù)

12．根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品對(duì)應(yīng)葡聚糖濃度

五、 計(jì)算樣品活性

[根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品對(duì)應(yīng)葡聚糖濃度（納摩爾/升）X樣品稀釋倍數(shù)]÷ X xx（分鐘）＝皮摩爾/毫升/分鐘÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝皮摩爾/毫克/分鐘

注意事項(xiàng)

1． 本產(chǎn)品為25次操作，包括標(biāo)準(zhǔn)樣

2． 操作時(shí)，須戴手套

3． 強(qiáng)化液（Reagent B）為固體狀，移取方法為：使用1毫升槍頭，將部分剪去；或使用0.5毫升PCR管的蓋子內(nèi)圈盛滿；或秤重0.1克

4． 終止液（Reagent E）具有腐蝕性，注意操作安全

5． 建議測(cè)定細(xì)胞裂解懸液的蛋白濃度，便于計(jì)算活性單位之需；建議使用－Bradford蛋白質(zhì)濃

6． 熒光測(cè)定后，比色皿須清洗*

7． 酶活性單位濃度定義：在28℃室溫下，pH 7.8的情況下，每單位酶在單位時(shí)間內(nèi)（每分鐘）合成1微摩爾的葡聚糖

8． 待測(cè)樣本為微粒體，其蛋白濃度為20微克/5微升；待測(cè)樣本為細(xì)胞裂解懸液，其蛋白濃度為100至200微克/5微升（本公司提供 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒）

9． 如果待測(cè)樣品濃度過(guò)高或過(guò)低，可以調(diào)整樣品濃度

10．本公司提供系列真菌/酵母細(xì)胞酶學(xué)相關(guān)試劑產(chǎn)品