細菌β-半乳糖苷酶活性比色法定量檢測試劑盒產品說明書（中文版）

主要用途

細菌β-半乳糖苷酶活性比色法定量檢測試劑是一種旨在使用化學方法，快速有效地裂解細菌細胞，通過高速離心，獲得澄清細菌裂解懸液，在β-半乳糖苷酶反應體系里，以鄰硝基苯基-β-D- 半乳糖苷為無色底物，水解所產生的亮黃色的鄰硝基酚，即采用比色法定量測定細菌裂解懸液制備樣品中的β-半乳糖苷酶活性的而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。廣泛應用于基因組學、蛋白質組學和其它分子生物學研究。其適用于活體細菌內源性或外源性β-半乳糖苷酶活性分析。產品即到即用，性能穩(wěn)定，參數(shù)優(yōu)化，操作簡便、比色敏感，堪稱上同類產品zui為上佳。

技術背景

大腸桿菌的標志基因Lac Z編碼β-半乳糖苷酶（β-galactosidase ； β-gal），在其催化作用下，半乳糖可從乳糖的水解作用中得到。β-半乳糖苷酶非常穩(wěn)定，對蛋白水解降解作用抗性強，且容易測試。因此β-半乳糖苷酶成為目前zui常用的報告基因，以評價載體轉染的效果。鄰硝基苯基-β-D-半乳糖苷（o-nitrophenyl-β-D-galactopyraniside；ONPG），是一種無色底物，以替代乳糖，在β-半乳糖苷酶的催化下，水解成無色的半乳糖和亮黃色的鄰硝基酚（o-nitrophenol；ONP），通過420nm波長的吸光值分析，來測定β-半乳糖苷酶的活性單位。

產品內容

保存方式

保存裂解液（Reagent A）、活性液（Reagent B）和反應液（Reagent D）在－20℃冰箱里，避免反復凍融；其余的保存在4℃冰箱里；反應液（Reagent D）避免光照；有效保證6月

用戶自備

15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器

（微型）臺式離心機：用于樣品操作

比色皿：用于比色分析的容器

恒溫水槽或培養(yǎng)箱：用于反應物孵育

計時器：用于反應計時

分光光度儀：用于比色分析

實驗步驟

實驗開始前，開啟分光光度儀預熱，設置波長420nm；開啟恒溫水槽，設置溫度為37℃。同時從－20℃冰箱里取出裂解液（Reagent A）、活性液（Reagent B）和反應液（Reagent D）置于冰槽里融化反應液（Reagent D）避免光照。然后進行下列操作：

• 樣品準備

• 準備好10毫升待測的細菌放進37℃搖床孵育16小時，速度為220RPM
• 移取500微升過夜培養(yǎng)的細菌到15毫升錐形離心管
• 加入用戶自備的10毫升新鮮培養(yǎng)液和誘導劑
• 放進37℃搖床孵育2小時，速度為220RPM（OD600＝0.4至0.8，即1至2 X 10⁷細胞/毫升）
• 置于冰槽里5分鐘
• 放進4℃臺式離心機離心5分鐘，速度為1000g
• 小心抽去上清液
• 加入xx微升裂解液（Reagent A），充分混勻
• 轉移到預冷的1.5毫升離心管
• 加入xx微升活性液（Reagent B）
• 強力渦旋震蕩15秒
• 置于冰槽里15分鐘
• 放進4℃微型臺式離心機離心15分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取500微升上清液到新的預冷的1.5毫升離心管
• 移取10微升進行蛋白定量檢測
• 即刻放進－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作

• 活性檢測

方法一：常規(guī)檢測（比色皿）

• 移取100微升上述制備的細菌細胞裂解懸液樣品到新的比色皿
• 加入xx微升稀釋液（Reagent C）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻
• 放進37℃恒溫水槽孵育5分鐘
• 加入xx微升反應液（Reagent D）（注意：使用前，充分混勻反應液（Reagent D）中可能的沉淀） 
• 上下傾倒數(shù)次，混勻，同時開啟計時器進行計時
• 放進37℃恒溫水槽孵育至少10分鐘，或直至出現(xiàn)亮黃色（注意：參見注意事項14）
• 加入xx微升終止液（Reagent E），同時關閉計時器結束計時
• 記錄反應所用的實際時間

10.  即刻放入分光光度儀檢測，記錄樣品吸光讀數(shù)

方法二：微量檢測（酶標板） 

• 移取10微升上述制備的細菌細胞裂解懸液樣品到酶標板中的1個孔里
• 加入xx微升稀釋液（Reagent C）
• 輕輕搖動酶標板數(shù)次，混勻
• 放進37℃培養(yǎng)箱孵育5分鐘
• 加入xx微升反應液（Reagent D）（注意：使用前，充分混勻反應液（Reagent D）中可能的沉淀） 
• 輕輕搖動酶標板數(shù)次，混勻，同時開啟計時器進行計時
• 放進37℃培養(yǎng)箱孵育至少10分鐘，直至出現(xiàn)亮黃色（注意：參見注意事項14）
• 加入xx微升終止液（Reagent E），同時關閉計時器結束計時
• 記錄反應所用的實際時間
• 即刻放入分光光度儀檢測，記錄樣品吸光讀數(shù)，

• 菌落直接檢測

• 移取xx微升裂解液（Reagent A）到1.5毫升離心管
• 加入xx微升稀釋液（Reagent C）
• 使用牙簽、200微升槍頭或接種環(huán)挑選1個完整菌落
• 渦旋震蕩15秒，混勻
• 放進分光光度儀檢測，波長為600nm，記錄讀數(shù)
• 放進37℃恒溫水槽孵育5分鐘
• 加入xx微升反應液（Reagent D）（注意：使用前，充分混勻反應液（Reagent D）中可能的沉淀） 
• 上下傾倒數(shù)次，混勻，同時開啟計時器進行計時
• 放進37℃恒溫水槽孵育至少10分鐘，直至出現(xiàn)亮黃色（注意：參見注意事項14）
• 加入xx微升終止液（Reagent E），同時關閉計時器結束計時
• 記錄反應所用的實際時間
• 放進4℃臺式離心機離心30秒，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取上清液到比色皿
• 即刻放入分光光度儀檢測，記錄樣品吸光讀數(shù)，

• 計算樣品活性

注意事項

• 本產品為20次（比色皿）操作
• 建議使用核內表達的載體代替胞內表達的載體轉染或感染細胞或組織
• 本產品的各項參數(shù)達到*化
• 所有操作均須無菌狀態(tài)下進行
• 操作時，須戴手套
• 反應液（Reagent D）避免光照和反復凍融
• 用戶可以測定細胞裂解懸液的蛋白濃度，便于計算活性單位之需
• 如果用戶需要測定背景空對照，可以*按照活性檢測的操作步驟進行，*變化在于100微升樣品改成100微升裂解液（Reagent A）替代
• 如果用戶測得背景空對照，計算活性時，勿忘（樣品吸光讀數(shù)－背景空對照讀數(shù)）
• 反應孵育時間的理想范圍為10分鐘至60分鐘內出現(xiàn)亮黃色顯色：低于5分鐘表明酶活性過高，建議稀釋樣品，否則影響檢測精度；大于60分鐘表明酶活性較低，建議增加樣品量，不要增加孵育時間
• 如果增加孵育時間3小時以上，可能產生反應底物的自動水解，影響檢測精度
• 如果用戶樣品有限，轉染困難，且酶活性過低，必須大量增加孵育時間
• 樣品的酶活性吸光值在0.1至1.2 OD單位為理想狀態(tài)，其酶活性與吸光值成線性正相關；吸光值在0.3至0.9 OD單位為狀態(tài)
• 亮黃色顯色的標準為等同于新鮮的LB培養(yǎng)液作為色彩參照，同時作為反應終止的標準
• 反應終止后，即刻進行比色測定
• 比色測定后，比色皿須清洗*
• 酶活性單位濃度定義：在37℃溫度下，每單位酶在單位時間內（每分鐘）水解1微摩爾的鄰硝基苯基-β-D-半乳糖苷
• 本公司提供系列β-半乳糖苷酶檢測試劑產品

質量標準

• 本產品經鑒定性能穩(wěn)定
• 本產品經鑒定檢測敏感