酵母雙雜交檢測(cè)（Yeast Two-Hybrid Assay）產(chǎn)品專題 

檢測(cè)原理：

酵母雙雜交系統(tǒng)（Yeast two-hybrid assay）是用于體內(nèi)研究蛋白相互作用的一種非常便利的工具，常用的如GAL4為基礎(chǔ)的系統(tǒng)，使用酵母轉(zhuǎn)錄因子GAL4來檢測(cè)轉(zhuǎn)錄激活后的蛋白相互作用。某些轉(zhuǎn)錄因子（如GAL4）由兩個(gè)可以分開，功能上相互獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域組成，N端有一個(gè)147個(gè)氨基酸組成的DNA結(jié)合域（DNA binding domain，BD），C端有一個(gè)由113個(gè)氨基酸組成的轉(zhuǎn)錄激活域（transcription activation domain，AD）。BD可以和上游激活序列（UAS）結(jié)合，而AD能激活UAS下游基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。單獨(dú)的BD或AD不能激活基因轉(zhuǎn)錄，兩者只有通過某種方式結(jié)合在一起形成完整的轉(zhuǎn)錄激活因子的功能【見圖1】。酵母雙雜交系統(tǒng)主要利用酵母GAL4的這個(gè)特性通過兩個(gè)雜交蛋白在酵母細(xì)胞中的相互結(jié)合及對(duì)報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄激活來研究活細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的相互作用，對(duì)蛋白質(zhì)之間微弱、瞬間的作用都能通過報(bào)告基因敏感的檢測(cè)到。

酵母雙雜交系統(tǒng)應(yīng)用：

1. 對(duì)新的與已經(jīng)蛋白相互作用的鑒定
2. 對(duì)預(yù)測(cè)蛋白相互作用的確認(rèn)
3. 對(duì)蛋白相互作用區(qū)域的鑒定

圖1. 雙雜交檢測(cè)原理圖。兩個(gè)蛋白分別表達(dá)，一個(gè)（誘餌蛋白bait protein）融合到Gal4 DNA結(jié)合域表達(dá)，另一個(gè)（誘捕蛋白prey protein）融合到Gal4轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（AD）表達(dá)。在Y2HGold酵母菌株中，只有當(dāng)兩個(gè)蛋白之間相互作用并結(jié)合到Gal4反應(yīng)性啟動(dòng)子上才能活化報(bào)告基因（AUR1-C, ADE2, HIS3, 和MEL1）的表達(dá)。

酵母雙雜交系統(tǒng)操作流程（以Clontech Matchmarker GAL4-based two hybrid assay為例）

完整的Matchmarker篩選過程包含以下步驟：

*步：執(zhí)行對(duì)照實(shí)驗(yàn)；

第二步：誘餌載體的構(gòu)建及自我激活和毒性檢測(cè)；

第三步：篩選Mate&Plate文庫

第四步：確認(rèn)和闡釋結(jié)果

圖3. 使用Mate&Plate文庫進(jìn)行雙雜交篩選。捕獲蛋白（bait protein）是酵母菌Y2HGold表達(dá)的Gal4 DNA-BD融合蛋白。高復(fù)雜性文庫表達(dá)Gal4 AD融合蛋白，由Y187酵母菌提供。當(dāng)兩種轉(zhuǎn)化菌株混合過夜能接合產(chǎn)生二倍體（Diploids）。此二倍體含有4個(gè)報(bào)告基因：HIS3，ADE2，MEL1和AUR1-C，受雙雜交作用而活化表達(dá)。

酵母雙雜交檢測(cè)需要產(chǎn)品信息：

我司（懋康生物）提供酵母雙雜交研究需要的一系列產(chǎn)品，從酵母菌株、酵母質(zhì)粒、酵母培養(yǎng)基到篩選標(biāo)志（抗生素），咨詢，，：2971634497。

一、富集培養(yǎng)基（Rich Medium 酵母培養(yǎng)）

【補(bǔ)充描述】：

1. YPD是用于大多數(shù)酵母菌生長(zhǎng)所需的酵母提取物、蛋白胨和葡萄糖優(yōu)化配比后組成的混合物；
2. YPDA培養(yǎng)基是在YPD基礎(chǔ)上添加硫酸腺嘌呤，終濃度120 µg/ml。

二、基本培養(yǎng)基（Minimal Medium 酵母培養(yǎng)）

【補(bǔ)充描述】：

1. SD Medium：酵母菌用的基本的合成限定培養(yǎng)基（Minimal synthetically defined medium），包含氮源，碳源（葡萄糖，除非有特殊說明）和DO添加劑（Dropout Supplement）。
2. DO（Dropout Supplement or Solution）：特定氨基酸和核苷的混合物，添加到SD base內(nèi)以配制SD Medium。DO缺少一種或者更多未轉(zhuǎn)化酵母菌需要的營(yíng)養(yǎng)成分使其在SD Medium上生長(zhǎng)，作為營(yíng)養(yǎng)篩選標(biāo)志。

三、省卻成分氨基酸混合物（DO Supplements 酵母培養(yǎng)）

四、篩選抗生素（底物）

【補(bǔ)充描述】：

1）Aureobasidin A （AbA）金擔(dān)子素A是報(bào)告基因AUR1-C的篩選抗生素，以判斷酵母菌是否能表達(dá)賦予其AbA抗性的酶。

2）X-α-Gal是α-半乳糖苷酶（由MEL1基因編碼）的底物，當(dāng)雙雜交發(fā)生時(shí)MEL1報(bào)告基因正常表達(dá)催化底物發(fā)生顏色反應(yīng)，使得酵母菌落呈藍(lán)色。

3）X-Gal是ß-半乳糖苷酶（由lacz基因編碼）的底物。

五、酵母質(zhì)粒提取試劑盒

【試劑盒工作原理】：

該試劑盒把硅膠柱純化技術(shù)同經(jīng)典的SDS堿裂解法結(jié)合起來，用戶可在1小時(shí)內(nèi)從酵母培養(yǎng)液中純化出高純度的質(zhì)粒DNA。純化過程不需用任何到有害的有機(jī)物抽提，亦不需用到耗時(shí)的乙醇沉淀。質(zhì)粒DNA的產(chǎn)量依賴于酵母攜帶質(zhì)粒的拷貝數(shù)，酵母菌株以及生長(zhǎng)條件。 一般來說，酵母質(zhì)粒的拷貝數(shù)較低，5.0ml過夜培養(yǎng)液中質(zhì)粒DNA產(chǎn)量約為1.0 µg左右。純化的質(zhì)?？芍苯佑糜诿盖?，PCR,電轉(zhuǎn)化等應(yīng)用。酵母收集后,加入破壁酶和玻璃珠去除細(xì)胞壁,用傳統(tǒng)堿裂法裂解細(xì)胞，然后將獲得的上清液轉(zhuǎn)移至結(jié)合柱結(jié)合DNA，經(jīng)過兩次快速洗滌，zui后用無菌水洗脫出質(zhì)粒DNA。

六、酵母轉(zhuǎn)化試劑盒

【補(bǔ)充描述】：

酵母質(zhì)粒轉(zhuǎn)化試劑盒，含PEG/liAC酵母轉(zhuǎn)化需要的所有試劑，操作簡(jiǎn)單，轉(zhuǎn)化效率高。

七、酵母雙雜交菌和感受態(tài)細(xì)胞

八、酵母菌載體

 — —Written/Edited by V. Shallan【版權(quán)歸MKBio懋康所有】

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