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Anopore氧化鋁膜是GE醫(yī)療集團(tuán)生命科學(xué)部Whatman膜產(chǎn)品家族中zui特殊的商業(yè)化無(wú)機(jī)膜，它誕生于上世紀(jì) 80 年代末。Anopore *孔隙結(jié)構(gòu)既是各種實(shí)驗(yàn)室的理想過(guò)濾介質(zhì)（如圖 1），還在細(xì)胞培養(yǎng)、藥物測(cè)試、納米技術(shù)等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。Anopore 的孔密度*，現(xiàn)有 200nm、100nm 和 20nm 三種標(biāo)準(zhǔn)孔徑，每個(gè)孔之間無(wú)橫向交叉，自身蛋白吸附率極低，熒光背底非常小，也是掃描電子顯微鏡（SEM）理想射線穩(wěn)定襯底。因?yàn)?Anopore 不含細(xì)胞毒素，剛性表面支持細(xì)胞的附著和迅速生長(zhǎng)，濕潤(rùn)時(shí)呈透明狀，在光學(xué)顯微鏡下極易觀察，既適合熒光和免疫熒光染色技術(shù)，又適合電子顯微鏡原位成像，它兼容現(xiàn)有的 DNA 提取技術(shù)，為細(xì)胞培養(yǎng)及其分析提供了的便利。
除了常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用外，Whatman 氧化鋁膜（Anopore）還可用于一些比較特殊的應(yīng)用，分別是：抗生素敏感性實(shí)驗(yàn)（AST）、快速藥物敏感性測(cè)試（DST）和模擬環(huán)境樣品的組織培養(yǎng)嵌入法（Tissue Culture Insert）。
圖 1 Anopore 膜電子顯微鏡照片
藥物敏感性試驗(yàn)通常用于了解病原微生物對(duì)各種抗生素的敏感或耐受程度來(lái)指導(dǎo)臨床用藥。致病微生物在 Anopore 氧化鋁膜上比其他方式培養(yǎng)生長(zhǎng)不易受到限制，有效縮短了培養(yǎng)時(shí)間。瑞士 Wageningen 大學(xué) C. J. Ingham 等[1]利用 0.2μm 孔徑的 Anopore 氧化鋁膜成功實(shí)施細(xì)菌抗生素敏感性試驗(yàn)。首先將滅菌的 Anopore 放在內(nèi)含抗生素的瓊脂板上，接下來(lái)在 Anopore 上接種待測(cè)細(xì)菌或真菌，置于 CO2培養(yǎng)箱中于 37oC 培養(yǎng) 40min 或數(shù)小時(shí)，然后
用熒光染料 Fun-1 利用 Anopore 毛細(xì)作用對(duì)細(xì)胞染色，zui后直接用顯微鏡觀察。研究發(fā)現(xiàn)，白色念球菌在 Anopore 表面可在 60min 內(nèi)檢測(cè)到生長(zhǎng)，毛癬菌則在 6h 后檢測(cè)到生長(zhǎng)，檢測(cè)MIC 值都與 E 試驗(yàn)法相當(dāng)而檢測(cè)時(shí)間更短，圖 2 是 Anopore 上致病微生物成像照片。
圖2 （A）熒光染色大腸桿菌 （B）志賀氏菌在Anopore膜上的SEM形貌 （C）熒光染色熱帶念球菌 （D）伸長(zhǎng)型志賀氏菌萌芽管形貌
Anopore還可以縮短總的藥物敏感性測(cè)試時(shí)間，因?yàn)橹虏∥⑸锟稍谘趸X膜（Anopore）上直接實(shí)施培養(yǎng)、殺死、染色和成像等步驟。C. J. Ingham等[2]運(yùn)用0.2μm孔徑的 Anopore培養(yǎng)接種高傳染性的結(jié)核桿菌（Mycobacterium tuberculosis），其中在Anopore上加入常規(guī)培養(yǎng)基（LJ）和75%甘油供細(xì)菌生長(zhǎng)，這種方法zui大程度縮短了測(cè)試時(shí)間（<3天），將感染性廢棄物降至zui?。?lt;2000個(gè)菌株形成單元），同時(shí)在Anopore膜上做熒光染色和掃描電鏡分析也極為方便（如圖3）。
圖3 結(jié)核桿菌在Anopore 表面生長(zhǎng)的電子顯微鏡照片
未來(lái)微生物多樣性的研究將成為熱點(diǎn)，但絕大多數(shù)細(xì)菌在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)方法中無(wú)法培養(yǎng)，比如標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室法培養(yǎng)出的土壤細(xì)菌不到1%。2002年以來(lái)，科學(xué)家們采用稀釋培養(yǎng)基、增加接種次數(shù)、模擬自然環(huán)境等來(lái)解決上述問(wèn)題，特別是模擬自然環(huán)境法已從培養(yǎng)海水中難以培養(yǎng)的微生物發(fā)展到培養(yǎng)土壤細(xì)菌中來(lái)，基于組織培養(yǎng)嵌入（TCI）的土壤基底膜系統(tǒng)法（SSMS）是目前zui有效的培養(yǎng)土壤細(xì)菌的方法之一。
澳大利亞New South Wales大學(xué)Belinda C Ferrari等[3]運(yùn)用20nm孔徑的Anopre膜作為T(mén)CI多孔板，先在Anopore孔內(nèi)填充環(huán)境土壤細(xì)漿料形成組織培養(yǎng)嵌入（TCI），接著把接種物轉(zhuǎn)移到聚碳酸酯膜（PC膜）上，再將PC膜蓋在反轉(zhuǎn)的（TCI）上，構(gòu)成了土壤基底膜系統(tǒng)（SSMS，如圖4），Anopore還能起到隔離和傳輸培養(yǎng)液的作用。研究發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)接種土壤細(xì)菌經(jīng)過(guò)7-10天的孕育期后，即可觀察到土壤菌落（如圖5），通過(guò)高靈敏度酶法可提取目標(biāo)土壤細(xì)菌DNA。此外，Anopore組織培養(yǎng)嵌入法還成功應(yīng)用于牛角膜細(xì)胞的培養(yǎng)，即用牛角膜血清、DMEM、抗生素等嵌入Anopore膜形成TCI培養(yǎng)基，培養(yǎng)的牛角膜細(xì)胞可做內(nèi)乳酸鹽-H+的傳輸機(jī)制研究等[4]。
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| 圖4 土壤基底膜系統(tǒng)（SSMS） | 圖5 PC膜土壤菌落的熒光顯微照片 |
參考文獻(xiàn)：
[1] Ingham C., Wever P., Schneeberger P. 16th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases Nice, France, April 1-4 2006
[2] C. J. Ingham, A. B. Ayad, K. Nolsen, B. MulderRapid drug susceptibility testing of mycobacteria by cultureon a highly porous ceramic support, INT J TUBERC LUNG DIS, 2008, 12(6):645–650
[3] Belinda C Ferrari, Tristrom Winsley, Michael Gillings, Svend Binnerup. C*ting previously uncultured soil bacteria using a soil substrate membrane system. Nature Protocols, 3(8): 1261-1269
[4] Tracy T. Nguyen, Joseph A. Bonanno. Bicarbonate, NBCe1, NHE, and Carbonic Anhydrase Activity Enhance Lactate-H Transport in Bovine Corneal Endothelium. Investigative Ophthalmology & Visual Science, 2011, 52(11):8086-8093
