污水處理設(shè)備 污泥處理設(shè)備 水處理過濾器 軟化水設(shè)備/除鹽設(shè)備 純凈水設(shè)備 消毒設(shè)備|加藥設(shè)備 供水/儲(chǔ)水/集水/排水/輔助 水處理膜 過濾器濾芯 水處理濾料 水處理劑 水處理填料 其它水處理設(shè)備
上海鈺博生物科技有限公司
會(huì)員1.png)
上海鈺博生物科技有限公司
閱讀：92發(fā)布時(shí)間：2017-7-18
細(xì)胞支原體污染的PCR檢測
支原體菌株來源：
M.Arginini ATCC23838 精氨酸支原體
M.FermentaneATCC19989發(fā)酵支原體
M.SalivariumATCC23064唾液支原體
M.HominisATCC23114人型支原體
M.OraleATCC23714口腔支原體
M.HyorhinisATCC29052豬鼻支原體
其共同引物序列來自16s和23s保守區(qū)域
外部引物為Ｆ1 5′-ＡＣＡＣＣＡＴＧＧＧＡＧＣＴＧＧＴＡＡＴ-3′
Ｒ1 5′-ＧＴＴＣＡＴＣＧＡＣＴＴＴＣＡＧＡＣＣＣＡＡＧＧＣＡＴ-3′；
內(nèi)部引物為Ｆ2 5′-ＧＴＴＣＴＴＴＧＡＡＡＡＣＴＧＡＡＴ-3′
Ｒ2 5′-ＧＣＡＴＣＣＡＣＣＡＡＡＡＡＣＴＣＴ-3′
ＰＣＲ反應(yīng)體系和條件：
10×緩沖液(10ｍＭＴｒｉｓ-ＨＣｌ、500ｍＭＫＣｌ、20ｍＭＭｇＣｌ2、0.01%明膠)、
ＰｒｉｍｅｒＦ1、Ｒ1、Ｆ2、Ｒ2的濃度為2ｎｍｏｌ/μＬ、
2.5ｍＭｄＮＴＰｓ、
Ｔａｑ酶、
Ｈ2Ｏ、
石蠟油覆蓋
反應(yīng)溫度和時(shí)間為:
94℃ /2ｍｉｎ預(yù)變性、94℃/30ｓ變性、55℃/1ｍｉｎ退火、72℃/1ｍｉｎ延伸
循環(huán)30次后72℃延伸5ｍｉｎ
第1次ＰＣＲ反應(yīng)取模板 10μＬ,第2次ＰＣＲ反應(yīng)以第1次ＰＣＲ擴(kuò)增產(chǎn)物為模板取1μＬ。
下面是更詳細(xì)的：
污染測試——支原體：PCR方法
原理： 利用具特殊專一性之primers，經(jīng)由PCR反應(yīng)來復(fù)制mycoplasma DNA。所用之primers來自mycoplasma之conserved 16S-23S rRNA序列，由于此段spacer之序列依m(xù)ycoplsma種類不同而不同，因此可依所復(fù)制之DNA大小及其restriction fragment大小差異來作偵測與鑒定。
特點(diǎn)：靈敏(e.g. 0.1~1.6 CFU / 5 ul sample) 與快速(一天)。可偵測不易培養(yǎng)之mycoplasma (e.g. M. hyorhinis)。不需培養(yǎng)mycoplasma作為正反應(yīng)對(duì)照組，避免可能之污染。
缺點(diǎn)：PCR反應(yīng)很靈敏，易有偽陽性結(jié)果。此方法尚在評(píng)估中，故結(jié)果僅作為參考和內(nèi)部品管之一部份。
材料與設(shè)備：
ATCC mycoplasma detection kit:可作50～100 reactions.
提供1st stage primer mixture與2nd stage primer mixture
positive control DNA (A. laidlawii ; M. pirum)
PCR reagents :
Taq polymerase ( 5 U / ul )
dNTP( dGTP, dCTP, dTTP, dATP, 1.25 mM each )
10x PCR buffer (with 1.5mM MgCl2)
25mM MgCl2
sterile ddH2O
Machine / Equipment：
PCR thermal cycler
agarose電泳設(shè)備
DNA電泳膠體觀察設(shè)備
無菌PCR反應(yīng)管
無菌1.5 ml微量離心管
無菌2ul, 20ul, 200ul, 1000ul Tips/ Pipetmans
方法： 此PCR反應(yīng)是一種nested PCR，包括2階段PCR反應(yīng)，1st stage PCR結(jié)束后，取其反應(yīng)物作2nd stage PCR，然后取2nd PCR產(chǎn)物作agarose gel electrophoresis，依DNA band之有無及片段大小來分析結(jié)果。
結(jié)果：使用UV light觀察，并照相記錄。
不過應(yīng)用較多還是巢式PCR
方法再詳盡點(diǎn)：
1st stage PCR reaction（total volume 25 ul）：
測試樣品 ( 2 ul / each )
直接取樣測試細(xì)胞之培養(yǎng)液。
Positive control : mycoplasma DNA ( A. laidlawii ; M. pirum )
Negative control : ddH2O
Reaction mixture ( 23 ul / each )
10x PCR buffer (含1.5 mM MgCl2 ) 2.5 ul
1st stage primer mixture 0.5 ul
dNTP ( 1.25 mM each ) 1.0 l
MgCl2 ( 25 mM ) 0.5 ul
Taq DNA polymerase ( 5 U/ul ) 0.1 ul
ddH2O 18.4 ul
PCR program ( 1st PCR與2nd PCR相同)：使用PCR thermal cycler
step 1 : denaturation: 94 ℃ 30 sec
step 2 : denaturation: 94 ℃ 30 sec
step 3 : annealing: 55 ℃ 2 min
step 4 : extension: 72 ℃ 2 min
重復(fù)3.1.3.2至3.1.3.4步驟30 cycles
step 5 : final extension 72 ℃ 5 min
2nd stage PCR reaction（total volume 25 ul）
測試樣品：1st stage PCR product（1 ul / each）。
Reaction mixture ( 24 ul / each )
10x PCR buffer (含1.5 mM MgCl2 ) 2.5 ul
nd stage primer mixture 0.5 ul
dNTP ( 1.25 mM each ) 1.0 ul
MgCl2 ( 25 mM ) 0.5 ul
Taq DNA polymerase ( 5U/ul ) 0.1 ul
ddH2O 19.4 ul
PCR program同3.1.3；使用PCR thermal cycler
膠片電泳分析
膠片 (2.0%) 置備: 將2 g agarose溶于100 ml ( 1x ) TAE buffer。
電泳液：(1x) TAE buffer（Tris-acetate/EDTA electropheresis buffer）
選擇100~500 bp DNA size Marker：取100 bp ladder Marker 5 ul ( 25 ng/ul )
取10 ul 2 nd stage PCR產(chǎn)物分析，各加入2 ul ( 6x ) loading dye。
進(jìn)行電泳分離100V, 25 min。
膠片染色：ethidium bromide染色10 min，H2O退染10mim。（EtBr為致癌物質(zhì)，請(qǐng)戴手套并小心操作）
結(jié)果：使用UV light觀察，并照相記錄。
環(huán)保在線 設(shè)計(jì)制作，未經(jīng)允許翻錄必究 .? ? ?
請(qǐng)輸入賬號(hào)
請(qǐng)輸入密碼
請(qǐng)輸驗(yàn)證碼
請(qǐng)輸入你感興趣的產(chǎn)品
請(qǐng)簡單描述您的需求
請(qǐng)選擇省份