酵母雙雜交(Yeast Two Hybrid, Y2H)可分為核蛋白體系酵母雙雜交和膜蛋白體系酵母雙雜交，兩種體系大致原理相同。以下為大家分別介紹：
 

　　1、核體系酵母雙雜交技術原理
 

　　核蛋白酵母雙雜交主要原理是基于酵母轉錄激活因子GAL4由兩個可以分開的、功能上相互獨立的結構域組成。其中N端的147個氨基酸組成GAL的DNA結合結構域(DNA binding domain, BD)，負責與基因上游的激活序列(upstream activating sequence, UAS)結合；C端的113個氨基酸組成GAL的轉錄激活結構域(transcription activation domain,AD)，負責激活UAS下游的基因轉錄過程。BD與AD在單獨存在時無法激活UAS下游基因轉錄，只有當BD與AD在空間上接近時才能發(fā)揮完整的轉錄因子功能，激活UAS下游基因的表達，使得菌落能夠在缺陷培養(yǎng)基中的生長情況或者通過顯色反應進行顯色。例如當報告基因為LacZ時，在培養(yǎng)基中加入顯色底物X-Gal，當BD與AD同時存在時，LacZ正常表達，生成β-半乳糖苷酶，將X-Gal切割成半乳糖和深藍色的底物5-溴-4氯靛藍，使得菌落呈現藍色。
 

圖 酵母GAL4轉錄激活示意圖
 

　　在進行酵母雙雜實驗時，將已知的誘餌蛋白X與BD結構域融合表達；捕獲蛋白Y與AD結構域融合表達。若蛋白A和蛋白B存在互作，則BD和AD在空間上會靠近，成為有活性的轉錄激活因子，激活下游報告基因表達；若蛋白A和蛋白B不存在互作，則BD和AD在空間上較遠，單獨無法發(fā)揮轉錄激活作用，報告基因不表達。酵母文庫構建和篩選則是將捕獲蛋白更換為蛋白文庫，構建融合表達AD結構域的文庫質粒，并形成酵母文庫，從而利用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選與誘餌蛋白A存在相互作用的未知蛋白。
 

圖酵母雙雜交原理示意圖
 

　　2、膜體系酵母雙雜交技術原理
 

　　膜蛋白酵母雙雜交主要原理是基于分離的泛素(split-ubiquitin)介導的DUAL membrane系統(tǒng)。該系統(tǒng)主要利用泛素(Ubiquitin,Ub)作為26S蛋白酶體降解蛋白標簽的特性，可分為N端(1-37個氨基酸NubI結構域，通常將第13位liangansuan突變?yōu)間anansuan或者binansuan(NubG)以降低與Cub的自重組)和C端(35-76個氨基酸Cub結構域)，當NubG和Cub相互靠近時，能夠發(fā)揮標簽功能，通過泛素修飾目標蛋白，使目標蛋白被泛素介導的蛋白酶體途徑識別并剪切。基于該原理，將Cub末端添加轉錄因子形成Cub-TF，在NubG與Cub-TF靠近后，可以將TF剪掉并進入細胞核，激活報道基因表達。
 

　　在進行膜體系酵母雙雜交實驗時，將誘餌蛋白X和獵物蛋白Y分別構建到Cub-TF載體和NubG載體，如果X和Y存在相互作用，則Cub-TF和NubG相互靠近，將TF進行泛素標記并被泛素特異性蛋白酶UBPs識別剪切后釋放并進入細胞核，激活報告基因表達。
 

圖 膜蛋白酵母雙雜交原理示意圖
 

　　技術優(yōu)勢
 

　　基于報告基因表達產物累積效應，檢測靈敏度高；
 

　　以報告基因為檢測對象，可用于檢測弱蛋白相互作用或者瞬時相互作用；
 

　　無需抗體或者蛋白純化操作；
 

　　相對其他方法，成本較低；
 

　　技術缺陷
 

　　由于部分基因具有自激活效應，因此可能存在假陽性；
 

　　一定程度可以模擬生理互作，但與哺乳細胞仍有一定區(qū)別；
 

　　外源蛋白可能對酵母具有毒性，抑制酵母生長，干擾實驗結果；
 

　　Y2H技術流程
 

　　1、酵母感受態(tài)細胞制備
 

　　PS：經費充足的小伙伴可以直接購買商用感受態(tài)細胞，省時省力，經費稍顯緊張的小伙伴就只能按照以下步驟付出人力成本啦。
 

　　(1)取- 80℃保存的酵母菌株涂布到YPDA培養(yǎng)基平板，28℃倒置培養(yǎng)4-7 d；
 

　　(2)挑取單克隆菌落加入到10 mL YPDA液體培養(yǎng)基中，30℃，250 rpm條件下震蕩培養(yǎng)至OD600 = 1.4-1.8，并逐步擴大培養(yǎng)至50-100 mL；
 

　　(3)待菌株生長至合適密度時(OD600 = 0.6-0.8)，收集菌液，1000 g轉速下室溫離心5 min，收集細胞沉淀；
 

　　(5)加入50 mL無菌超純水(或者生理鹽水)重懸酵母細胞進行洗滌；
 

　　(6)1000 g轉速下室溫離心5 min，收集細胞沉淀；
 

　　(7)加入3 mL 1.1 × TE/LiAc重懸酵母細胞進行洗滌；
 

　　(8)重懸的酵母細胞等體積轉移至新的離心管，6000 g轉速下室溫離心30 s；
 

　　(9)收集沉淀并加入適量1.1 × TE/LiAc重懸酵母細胞，分裝至100 μL/管，-80℃保存?zhèn)溆谩?br /> 

　　2、酵母轉化
 

　　(1)取出酵母感受態(tài)細胞，分別加入10 μL ssDNA，0.1 μg質粒，PEG/LiAc 600 μL，渦旋混勻。(PS: ssDNA作用類似于鮭魚精DNA，避免質粒在轉入真核細胞中被降解。）
 

　　(2)30℃水浴30 min，加入70 μL DMSO；
 

　　(3)42℃熱激15 min，冰上冷卻2 min；
 

　　(4)2000 g轉速下室溫離心10 s，棄上清；
 

　　(5)加入1 mL無菌水(或者生理鹽水)重懸沉淀；
 

　　(6)吸取200 μL轉化混合物涂布到營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)平板中；
 

　　(7)28℃倒置培養(yǎng)2-4 d，觀察菌落生長情況。
 

圖 酵母雙雜交實驗流程示意圖(圖片來源于網絡)
 

　　由于酵母雙雜交系統(tǒng)可能存在自激活現象(與BD結構域結合的誘餌蛋白具有轉錄激活活性，在BD結合UAS序列后無需AD結構域即可激活下游報告基因表達；或者與BD結構域結合的誘餌蛋白與酵母內源具有轉錄激活活性的蛋白互作，激活下游報告基因表達)。為保證酵母雙雜交實驗結果的真實可靠性，在進行實驗時通常設置陰性對照組和陽性對照組、自激活組以及實驗組等(以核體系酵母雙雜交為例)。
 

　　陰性對照組：pGBKT7-Lam + pGADT7-ADT；
 

　　陽性對照組：pGBKT7-P53 + pGADT7-ADT；
 

　　自激活組：pGBKT7-X + pGADT7；
 

　　實驗組：pGBKT7-X + pGADT7-Y；
 

　　對照組(可選)：pGBKT7 + pGADT7；pGBKT7 + pGADT7-Y；
 

　　酵母雙雜交實驗時通常使用SD/ -Trp/ -Leu二缺培養(yǎng)板，用于驗證質粒轉化效果；SD/ -Trp/ -Leu/ -His三缺培養(yǎng)板，用于驗證是否存在自激活；SD/ -Trp/ -Leu/- His/ -Ade為四缺培養(yǎng)板，用于主要驗證互作結果。
 

酵母雙雜交結果示意圖(圖片參考網絡繪制)
 

　　如上圖所示，在二缺板中，所有分組均有菌落，說明質粒轉化成功。
 

　　pGBKT7-Lam + pGADT7-ADT組為陰性對照，由于Lam和ADT不存在互作，無法激活下游報告基因表達，因此在三缺板和四缺板中均未出現菌落；
 

　　pGBKT7-P53 + pGADT7-ADT組為陽性對照，由于P53與ADT存在互作，BD和AD靠近，激活下游報告基因表達，因此在三缺和四缺板中長出菌落；
 

　　pGBKT7-X + pGADT7為自激活組，若蛋白X沒有轉錄激活活性或者不存在具有轉錄激活活性的酵母內源蛋白與X互作，則三缺板和四缺板中無法長出菌落；若存在自激活現象，則在三缺板和四缺板中長出菌落；
 

　　pGBKT7-X + pGADT7-Y為實驗組，由于蛋白X和蛋白Y存在相互作用，因此能夠激活下游報告基因表達，可在三缺和四缺板中長出菌落。
 

　　PS：如果在培養(yǎng)板中加入X-gal，則在進行酵母雙雜交實驗時，陽性菌落因表達報告基因LacZ，將X-gal切割將成半乳糖和深藍色的底物5-溴-4氯靛藍，使得菌落呈現藍色；這也是為什么有些文章酵母雙雜交實驗菌落顏色為藍色。
 

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