電泳條帶成笑臉狀

膠不均勻冷切，中間冷卻不好，電泳系統(tǒng)溫度偏高

減少電壓減慢電泳速度，在冷室或者冰浴中進(jìn)行電泳

電泳條帶成皺眉狀

可能是由于裝置不合適，特別可能是凝膠和玻璃擋板底部有氣泡，或者兩邊聚合不w全

調(diào)整裝置

拖尾

樣品溶解不好

樣品充分溶解混勻后上樣

紋理(縱向條紋)

樣品中含有不溶性顆粒

樣品充分?jǐn)嚢杌靹?/span>

條帶偏斜

電極不平衡或者加樣位置偏斜

調(diào)整電極和加樣

條帶兩邊擴(kuò)散

加樣量過多

適當(dāng)減少上樣量

Marker 變黑色

抗體和 Marker 蛋白反應(yīng)

在 Marker 和 sample 之間空出一個(gè)孔不上樣

背景高

膜封閉不夠

延長封閉時(shí)間，選擇適宜的抗體稀釋度

一抗稀釋度不適宜

對(duì)抗體進(jìn)行滴度測試，選擇適宜的抗體稀釋度

一抗孵育的溫度偏高

建議 4℃ 結(jié)合過夜

二抗?jié)舛榷冗^高

降低二抗?jié)舛?/span>

二抗的非特異性背景

增加一個(gè)二抗對(duì)照，不加一抗，其他操作過程不變，即可驗(yàn)證背景是否是由于二抗所致?？蛇x擇其它二抗（特異性更強(qiáng)的，只針對(duì)重鏈）

二抗孵育時(shí)間過久

減少二抗孵育時(shí)間

選擇膜的問題

硝酸纖維素的背景會(huì)比 PVDF 膜低

膜在實(shí)驗(yàn)過程中干過

實(shí)驗(yàn)過程中要注意保持膜的濕潤

檢測時(shí)曝光時(shí)間過長

注意曝光時(shí)間的縮短

洗膜不充分

增加洗膜的時(shí)間和次數(shù)

抗體和封閉蛋白有交叉反應(yīng)

檢測抗體與封閉蛋白的交叉反應(yīng)性，選擇無交叉反應(yīng)的封閉劑。洗滌液中加入 Tween-20 可減少交叉反應(yīng)

雜帶較多

目的蛋白有多個(gè)修飾位點(diǎn)（磷酸化位點(diǎn)，糖基化位點(diǎn)，乙?；稽c(diǎn)等），本身可以呈現(xiàn)多條帶

查閱文獻(xiàn)或進(jìn)行生物信息學(xué)分析，獲得蛋白序列的修飾位點(diǎn)信息，通過去修飾確定蛋白試劑大小

目的蛋白有其他剪切本

查閱文獻(xiàn)或生物信息學(xué)分析可能性

樣品處理過程中目的蛋白發(fā)生降解

裂解液中加入蛋白酶抑制劑，樣品處理在冰上進(jìn)行

上樣量過高，太敏感

適當(dāng)減少上樣量

一抗不純

純化抗體

一抗特異性不高

重新選擇或制備高特異性的抗體

二抗的非特異性結(jié)合

增加一個(gè)二抗對(duì)照，不加一抗，其他操作過程不變，即可驗(yàn)證背景是否是由于二抗所致?？蛇x擇其它二抗（特異性更強(qiáng)的，只針對(duì)重鏈）

一抗或二抗?jié)舛绕?/span>

降低抗體濃度

細(xì)胞傳代較多，導(dǎo)致蛋白變異

使用原代或傳代少的細(xì)胞作對(duì)照

蛋白條帶位置

（大?。┎粚?duì)

二聚體或多聚體存在

增加蛋白質(zhì)變性過程及強(qiáng)度

翻譯后剪切

比如很多蛋白是以前體蛋白的形式合成的，在執(zhí)行功能時(shí)需要進(jìn)行剪切成活化的形式

相對(duì)電荷

氨基酸電荷的組成

蛋白修飾

比如糖基化、磷酸化等修飾狀態(tài)會(huì)導(dǎo)致蛋白分子量增加

膠濃度

不同濃度的膠跑出的蛋白條帶的位置可能有所偏差

無蛋白條帶

抗體孵育不充分

增加抗體濃度，延長孵育時(shí)間

酶失活

直接將酶和底物進(jìn)行混合，如果不顯色則說明酶失活了。選擇在有效期內(nèi)、有活性的酶聯(lián)物

標(biāo)本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低

設(shè)置陽性對(duì)照，如果陽性對(duì)照有結(jié)果，但標(biāo)本沒有則可能是標(biāo)本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低。可考慮增加標(biāo)本上樣量解決靶蛋白含量低的原因

試劑之間不匹配

一抗與組織種屬，一抗與二抗或/和底物與酶系統(tǒng)之間不匹配。通過設(shè)置內(nèi)參照可以驗(yàn)證二級(jí)檢測系統(tǒng)的有效性

一抗失效

選擇在有效期內(nèi)抗體，幷選擇現(xiàn)配現(xiàn)用的工作液

HRP 抑制劑

所用溶液和容器內(nèi)避免含有疊D化鈉

抗體不能識(shí)別測試種屬的相關(guān)蛋白

購買抗體前應(yīng)認(rèn)真閱讀抗體說明書，確定其是否能夠交叉識(shí)別測試種屬的對(duì)應(yīng)蛋白

二抗與一抗不匹配

選擇針對(duì)一抗來源種屬的抗體

蛋白條帶信號(hào)弱

抗體孵育不充分

增加抗體濃度，延長孵育時(shí)間

酶活性降低

直接將酶和底物進(jìn)行混合，如果不顯色則說明酶失活了。選擇在有效期內(nèi)、有活性的酶聯(lián)物

洗膜過度

洗膜時(shí)間不宜過長，加入的去垢劑不宜過強(qiáng)或過多，建議使用 0.1% 的弱去垢劑 Tween-20

標(biāo)本中靶蛋白含量太低

增加樣本上樣量

抗體活性降低

選擇有效期內(nèi)的抗體，工作液現(xiàn)配現(xiàn)用，避免長時(shí)間放置

蛋白轉(zhuǎn)移不充分

可以用麗春紅染膜幷結(jié)合染膠（考馬斯藍(lán)）后確定條帶是否轉(zhuǎn)移到膜上或轉(zhuǎn)移過度，適當(dāng)調(diào)整轉(zhuǎn)膜的時(shí)間和電流

封閉過度

減少封閉劑的量或縮短時(shí)間，換用不同封閉劑類型

曝光時(shí)間過短

延長曝光時(shí)間

HRP 抑制劑

所用溶液和容器內(nèi)避免含有疊D化鈉

背景有黑色斑點(diǎn)

抗體與封閉試劑反應(yīng)

使用前過濾封閉試劑

HRP 偶聯(lián)二抗中有聚集體

過濾二抗試劑，去除聚集體

暗背景上白色帶

HRP 含量過高

降低酶聯(lián)二抗的濃度

背景有不均勻的白色斑點(diǎn)

轉(zhuǎn)膜過程中有氣泡存在

仔細(xì)檢測，避免存在氣泡

抗體分布不均勻

孵育抗體時(shí)使用搖床