Amplite NAD/NADH比率檢測試劑盒（熒光法）紅色熒光是美國AAT Bioquest研發(fā)的檢測NAD/NADH的試劑盒，煙*胺腺嘌呤二核苷酸（NAD +）和煙*胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP +）是細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的兩種重要的輔因子。 NADH是NAD +的還原形式，NAD +是NADH的氧化形式。 NAD形成NADP，通過酯鍵將磷酸基團(tuán)添加到腺苷核苷酸的2'位置。 NADP用于合成代謝生物反應(yīng)，例如脂肪酸和核酸合成，其需要NADPH作為還原劑。 在葉綠體中，NADP是在光合作用的初步反應(yīng)中重要的氧化劑。 通過光合作用產(chǎn)生的NADPH用作卡爾文光合作用循環(huán)中生物合成反應(yīng)的還原能力。 傳統(tǒng)的NAD / NADH和NADP / NADPH測定通過監(jiān)測340nm處NADH或NADPH吸收的變化來完成。 該方法具有低靈敏度和高干擾，因?yàn)樵摐y定在需要昂貴的石英微孔板的UV范圍內(nèi)進(jìn)行。

這種Amplite 熒光NAD / NADH比率分析試劑盒為敏感檢測NAD，NADH及其比例提供了一種便捷的方法。 系統(tǒng)中的酶特異性識別酶循環(huán)反應(yīng)中的NAD / NADH，其顯著提高了檢測靈敏度。 此外，該測定具有非常低的背景，因?yàn)槠湓诩t色可見范圍內(nèi)運(yùn)行，這顯著降低了來自生物樣品的干擾。 無需從樣品混合物中純化NAD / NADH。 可以以方便的96孔或384孔微量滴定板形式進(jìn)行測定。 其信號可以通過熒光酶標(biāo)儀在Ex / Em = 530-570 / 590-600nm（大Ex / Em = 540/590nm）或吸光度酶標(biāo)儀在~576nm處容易地讀取。 該試劑盒提供NAD和NADH提取緩沖液，以及細(xì)胞裂解緩沖液，方便您使用。 它經(jīng)常用于從細(xì)胞裂解物中測定NAD / NADH。百螢生物是AAT Bioquest的中國代理商，為您提供優(yōu)質(zhì)的Amplite NAD/NADH比率檢測試劑盒（熒光法）。

實(shí)驗(yàn)方案

96孔板測定示例

概述

準(zhǔn)備25μLNADH標(biāo)準(zhǔn)品和/或測試樣品

添加25μLNADH或NAD提取溶液

在室溫下孵育15分鐘

加入25μLNAD或NADH萃取溶液

加入75μLNAD/ NADH反應(yīng)混合物

在室溫下孵育15分鐘至2小時(shí)

監(jiān)測Ex / Em = 540 / 590nm處的熒光強(qiáng)度

注意：在開始實(shí)驗(yàn)之前，在室溫下解凍每個試劑盒組分中的一個。

操作方法

1.準(zhǔn)備NADH儲備溶液：

將200μLPBS緩沖液加入到NADH標(biāo)準(zhǔn)品（組分C）的小瓶中，得到1mM（1nmol / L）NADH儲備溶液。

注意：未使用的NADH儲備溶液應(yīng)分成單次使用的等分試樣并儲存在-20℃。

2.準(zhǔn)備NAD / NADH反應(yīng)混合物：

將10mL NADH傳感器緩沖液（組分B）加入NAD / NADH再循環(huán)酶混合物（組分A）的瓶中，并充分混合。

注意：這種NAD / NADH反應(yīng)混合物足以用于兩個96孔板。 未使用的NAD / NADH反應(yīng)混合物應(yīng)分成一次性等分試樣并儲存在-20℃。

3.準(zhǔn)備連續(xù)稀釋的NADH標(biāo)準(zhǔn)品（0至10μM）：

3.1將30μL1mMNADH儲備溶液（來自步驟1）加入970μLPBS緩沖液（pH7.4）中，得到30μM（30pmol / L）NADH標(biāo)準(zhǔn)溶液。

注意：稀釋的NADH標(biāo)準(zhǔn)溶液不穩(wěn)定，應(yīng)在4小時(shí)內(nèi)使用。

3.2取200μL30M NADH標(biāo)準(zhǔn)溶液（來自步驟3.1）進(jìn)行1：3連續(xù)稀釋，得到10,3,1,0.3,0.1,0.03和0 M系列稀釋的NADH標(biāo)準(zhǔn)品。

3.3如表1和2中所述，將連續(xù)稀釋的NADH標(biāo)準(zhǔn)品和/或含NAD / NADH的測試樣品添加到固體黑色96孔微量培養(yǎng)板中。

注意：根據(jù)需要準(zhǔn)備細(xì)胞或組織樣本。

表1.實(shí)心黑色96孔微孔板中NADH標(biāo)準(zhǔn)品和測試樣品的布局

注意：NS = NAD / NADH標(biāo)準(zhǔn); BL =空白對照; TS =測試樣品; TS（NADH）=用NADH萃取溶液處理10至15分鐘的測試樣品，然后用NAD萃取溶液中和; TS（NAD）=用NAD提取溶液處理10至15分鐘的測試樣品，然后用NADH提取溶液中和。

表2每個孔的試劑組成

*注意：將連續(xù)稀釋的NADH標(biāo)準(zhǔn)品從0.03μM至30μM加入NS1至NS7的孔中，一式兩份。 高濃度的NADH（例如，>300μM，終濃度）可能由于NADH傳感器（非熒光產(chǎn)物）的過度氧化而導(dǎo)致熒光信號降低。

3.4對于NADH提?。∟ADH）：將25μLNADH提取溶液（組分D）加入含有NAD / NADH的測試樣品的孔中。 在室溫下孵育10至15分鐘，然后加入25μLNAD提取溶液（組分E）以中和NADH提取物，如表1和2中所述。

對于NAD提取（NAD）：將25μLNAD提取溶液（組分E）加入含有NAD / NADH的測試樣品的孔中。 在室溫下孵育10至15分鐘，然后加入25μLNADH提取溶液（組分D）以中和NAD提取物，如表1和2中所述。

對于總NAD和NADH：將25μLNAD/ NADH對照溶液（組分F）加入NADH標(biāo)準(zhǔn)品和含有NAD / NADH的測試樣品的孔中。 在室溫下孵育10至15分鐘，然后如表1和2中所述添加25μL對照溶液（組分F）。

注意1：根據(jù)需要準(zhǔn)備細(xì)胞或組織樣本。 NAD / NADH裂解緩沖液（組分G）可用于裂解細(xì)胞（詳見附錄）。

注意2：在健康的哺乳動物細(xì)胞中，與NADH相比，NAD更多，因此可以簡單地使用總NAD和NADH減去NAD來計(jì)算NADH的量。

4.在上清液反應(yīng)中運(yùn)行NAD / NADH測定：

4.1將75μLNADH反應(yīng)混合物（來自步驟2）加入NADH標(biāo)準(zhǔn)品，空白對照和測試樣品（來自步驟3.4）的每個孔中，使得總NADH測定體積為150μL/孔。

4.2在室溫下孵育反應(yīng)15分鐘至2小時(shí)，避光。

4.3用Ex / Em = 540 / 590nm（截止值570nm）的熒光板讀數(shù)器監(jiān)測熒光增加。

注意：也可以將板的內(nèi)容物轉(zhuǎn)移到白色透明底板上，并用吸光度酶標(biāo)儀在576±5nm的波長下讀數(shù)。 與熒光讀數(shù)相比，吸收檢測具有較低的靈敏度。