本試劑盒僅供研究使用
檢測范圍：50 ng/ml -400 ng/ml
zui低檢測限：20 ng/ml
預(yù)期應(yīng)用：本試劑盒可檢測小麥、玉米和飼料中的DON。
有效期：6個月
說明
1. 試劑盒保存： 2-8℃避光保存。
2. 濃洗滌液低溫保存會有鹽析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶。
3. 中、英文說明書可能會有不一致之處，請以英文說明書為準(zhǔn)。
4. 剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會含有少許水樣物質(zhì)，此為正?，F(xiàn)象，不會對實驗結(jié)果造成任何影響。
實驗原理
本試劑盒采用間接競爭酶聯(lián)免疫吸附ELSIA原理快速定量檢測小麥、玉米和飼料中的DON。
試劑盒組成及試劑配制
1. 酶聯(lián)板（Assay plate ）： 一塊（96孔）。
2. 標(biāo)準(zhǔn)品（Standard）： 4×1ml/瓶。
| 標(biāo)準(zhǔn)品 | S1 | S2 | S3 | S4 |
| 濃度（ng/ml） | 50 | 100 | 200 | 400 |
3. DON抗體（DON Antibody）： 1×6ml/瓶。
4. 酶標(biāo)二抗（Conjugate）： 1×12ml/瓶。
5. 顯色液（Substrate）： 1×12ml/瓶。
6. 濃洗滌液（Wash Buffer）： 1×25ml/瓶，使用時每瓶用蒸餾水稀釋20倍。
7. 終止液（Stop Solution）： 1×6ml/瓶（2N H2SO4）。
需要而未提供的試劑和器材
1. 標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格酶標(biāo)儀
2. 高速離心機(jī)
3. 電熱恒溫培養(yǎng)箱
4. 干凈的試管和Eppendof管
5. 系列可調(diào)節(jié)移液器及吸頭，一次檢測樣品較多時，用多通道移液器
6. 蒸餾水，容量瓶等
標(biāo)本處理
1. 脂肪含量低的固體樣品（大米、玉米和小麥等）
稱取5g粉碎樣品于100ml帶塞三角瓶中，加入25ml超純水或蒸餾水。充分振蕩3分鐘，然后用定性濾紙過濾，收集濾液。取濾4ml，加入4ml 超純水或蒸餾水，混勻，定性濾紙過濾，此為樣品待檢液。
2. 啤酒、麥乳汁
稱5ml樣品于100ml帶塞三角瓶中，加入45ml超純水或蒸餾水，混勻，定性濾紙過濾，此為樣品待檢液。
注意事項
1. 某些樣品待檢液（如花生等）久置影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，為保證檢測的準(zhǔn)確性，樣品提取后請即時檢測。
2. 若樣品待檢液不立即檢測，請將其存儲于棕色玻璃瓶內(nèi)，2-8℃避光保存。
3. 試劑盒在使用前，請將試劑盒內(nèi)所有試劑放到室溫（20-25℃）進(jìn)行溫度平衡。試劑用完后立即將其放置回 2-8℃冰箱內(nèi)保存。
4. 在每個步驟操作時，速度要快，不要使板孔暴露在空氣中時間過久，避免酶標(biāo)板變干。
操作步驟
1. 實驗準(zhǔn)備：從冰箱取出試劑盒，恢復(fù)至室溫。濃縮洗滌液用超純水或蒸餾水稀釋20倍，待用。
2. 加樣：分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔?？瞻卓准酉礈煲?/span>100μl（不加DON抗體）.余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品50μl，然后再加入DON 抗體50μl。注意不要有氣泡，加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜，37℃反應(yīng)30分鐘。
為保證實驗結(jié)果有效性，每次實驗請使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。
3. 棄去孔內(nèi)液體，甩干，用洗滌液洗板4次，每次浸泡1-2分鐘，200μl/每孔，甩干。
4. 每孔加酶標(biāo)二抗 100μl，37℃，30分鐘。
5. 溫育后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板4次，每次浸泡1-2分鐘，200μl/每孔，甩干。
6. 依序每孔加顯色液100μl，37℃避光顯色（10分鐘內(nèi)，此時肉眼可見標(biāo)準(zhǔn)品的前3-4孔有明顯的梯度藍(lán)色，后3-4孔顯色不明顯，即可終止）。
7. 依序每孔加終止溶液50μl，終止反應(yīng)（此時藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性，底物反應(yīng)時間到后應(yīng)盡快加入終止液。
8. 用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）。在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行檢測。
實驗備注
1. 用戶在初次使用試劑盒時，應(yīng)將各種試劑管離心數(shù)分鐘，以便試劑集中到管底。
2. 每次實驗留一孔作為空白調(diào)零孔，該孔不加任何試劑，只是zui后加顯色液及2N H2SO4。測量時先用此孔調(diào)OD值至零。
3. 為防止樣品蒸發(fā)，試驗時將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi)，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜。
4. 未使用完的酶標(biāo)板或者試劑，請于2-8℃保存。
5. 建議檢測樣品時均設(shè)雙孔測定，以保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。
洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體；在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標(biāo)板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml注入孔內(nèi)，浸泡1-2分鐘。根據(jù)需要，重復(fù)此過程數(shù)次。
自動洗板：如果有自動洗板機(jī)，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實驗過程中。
計算
以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)（對數(shù)坐標(biāo)），OD值為縱坐標(biāo)（普通坐標(biāo)），在半對數(shù)坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。
注意事項
1. 洗滌過程非常重要，不充分的洗滌易造成假陽性。
2. 一次加樣時間控制在5分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。
3. 請每次測定的同時做標(biāo)準(zhǔn)曲線，做復(fù)孔。
4. 如標(biāo)本中待測物質(zhì)含量過高，請先稀釋后再測定，計算時請zui后乘以稀釋倍數(shù)。
5. 底物請避光保存。
6. 不要用其它生產(chǎn)廠家的試劑替換試劑盒中的試劑。
