朗伯-比爾定律(Lambert-Beer law，A=ebc)是分光光度法的基本定律，也是利用分光光度法進行物質(zhì)定量的理論基礎(chǔ)。該定律描述了特定物質(zhì)(摩爾吸收系數(shù)，e，屬于物質(zhì)的物理性質(zhì))對某一波長光吸收的強弱程度(吸光度，A)與吸光物質(zhì)的濃度(c)、光程(即溶液厚度，b)之間的關(guān)系。
其物理意義是，當一束平行單色光垂直通過某一均勻非散射的吸光物質(zhì)時，其吸光度(A)與吸光物質(zhì)的濃度(c)、光程(b)均成正比例關(guān)系，而與透光率(T)成反比例關(guān)系。
(1)入射光為平行單色光且垂直照射；
(2)吸光物質(zhì)為均勻非散射體系，即待測物需為均一的稀溶液、氣體等，無溶質(zhì)、溶劑及懸濁物引起的散射；
(3)吸光質(zhì)點之間無相互作用；
(4)輻射與物質(zhì)之間的作用于光吸收，無熒光和光化學現(xiàn)象發(fā)生。
由此就可以分析出導致偏離朗伯-比爾定律的原因有以下幾點：
嚴格說來，朗伯-比爾定律只適用于單色光。但由于儀器分辨能力所限，入射光實際為一很窄波段的譜帶。由于分光光度計分光系統(tǒng)中的色散元件分光能力差，即在工作波長附近或多或少含有其他雜色光，雜散光(非吸收光)也會對朗伯-比爾定律產(chǎn)生影響，這些雜色光將導致朗伯-比爾定律的偏離。實際上，理論上的單色光是不存在的，我們所做的只能是讓入射光的光譜帶寬盡可能的小，要盡可能的靠近單色光。
另外，來自出射狹縫的光，其光譜帶寬度大于吸收光譜帶時，則投射在試樣上的光就存在非吸收。這不僅會導致靈敏度的下降，而且使標準曲線向下彎曲，從而偏離朗伯-比爾定律。非吸收光越強，對測定靈敏度影響就越嚴重。并且隨著被測試樣濃度的增加，非吸收光的影響增大。當吸收很小時，非吸收光的影響可忽略不計。
朗伯-比爾定律只適用于稀溶液。當濃度過高時，吸光粒子間的平均距離減小，受粒子間電荷分布相互作用的影響，其摩爾吸收系數(shù)發(fā)生改變，導致偏離比爾定律。
在不同的溶劑中，由于溶質(zhì)和溶劑的作用，生色團和助色團會發(fā)生相應(yīng)的變化，使吸收光譜的波長向長波長方向移動或向短波長方向移動，即所謂的紅移和藍移。例如，碘在溶液中呈紫色，在乙醇中呈棕色。
朗伯-比爾定律是適用于均勻、非散射的溶液。那么，如果被測試液不均勻，是膠體溶液、乳濁液或懸浮液，則入射光通過溶液后，除了一部分被試液吸收，還會有反射、散射使光損失，導致透光率減小，使透射比減小，使實際測量吸光度增大，使標準曲線偏離直線向吸光度軸彎曲，造成對朗伯-比爾定律的偏離。所以，在分析條件選擇時，應(yīng)考慮往樣品溶液的測量體系中加入適量的表面活性劑等來改善溶質(zhì)的均勻度。
朗伯-比爾定律也會受到化學因素的影響。解離、締合、生成絡(luò)合物或溶劑化等均會對朗伯-比爾定律產(chǎn)生偏離。離解是偏離朗伯-比爾定律的主要化學因素。當溶液濃度改變，其離解程度也會發(fā)生變化，這將導致吸光度與濃度的比例關(guān)系便發(fā)生變化，從而偏離朗伯-比爾定律。
溶液中有色質(zhì)點的聚合與締合，形成新的化合物或互變異構(gòu)等化學變化，以及某些有色物質(zhì)在光照下的化學分解、自身的氧化還原、干擾離子和顯色劑的作用等，都對遵守朗伯-比爾定律產(chǎn)生不良影響。
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