一、目的和要求

1. 了解管碟法的原理。

2. 掌握二劑量法測(cè)定抗生素效價(jià)單位的技術(shù)和計(jì)算方法。

二、原理

抗生素的生物檢定是以抗生素對(duì)微生物的抗菌效力作為效價(jià)的衡量標(biāo)準(zhǔn)，具有與應(yīng)用原理相一致、用量少和靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。管碟法是瓊脂擴(kuò)散法中的一種，已被各國(guó)藥典廣泛采用，作為法定的抗生素生物檢定方法。

當(dāng)抗生素在菌層培養(yǎng)基中擴(kuò)散時(shí)，會(huì)形成抗生素濃度由高到低的自然梯度，即擴(kuò)散中心濃度高而邊緣濃度低。因此，當(dāng)抗生素濃度達(dá)到或高于MIC（zui低抑制濃度）時(shí)，試驗(yàn)菌就被抑制而不能繁殖，從而呈現(xiàn)透明的抑菌圈。根據(jù)擴(kuò)散定律的推導(dǎo)，抗生素總量的對(duì)數(shù)值與抑菌圈直徑的平方成線性關(guān)系。

三、實(shí)驗(yàn)材料

1. 四環(huán)素類抗生素的標(biāo)準(zhǔn)品和樣品。

2. 試驗(yàn)菌：藤黃八疊球菌（Sarcina lutea）。

3. 培養(yǎng)基：250ml三角瓶分裝150ml LB瓊脂，150ml三角瓶分裝50ml LB瓊脂，50ml三角瓶分裝20ml藤黃八疊球菌懸液用培養(yǎng)液。

4. 滅菌物品：培養(yǎng)皿，牛津杯（內(nèi)徑：6.0±0.1mm，外徑：7.8±0.1mm，高度：10.0±0.1mm），滴管，1ml吸管，pH6.0的磷酸緩沖液，彎頭鑷子，15×150mm試管，瓦蓋。

5. 其它：分析天平，容量瓶，玻璃板，水平儀，游標(biāo)卡尺。

四、實(shí)驗(yàn)實(shí)施

1. 配制標(biāo)準(zhǔn)品溶液

2. 配制樣品溶液

3. 制備菌懸液。

4. 制備平板：

（1）取6套無(wú)菌培養(yǎng)皿，分別加入約20mlLB培養(yǎng)基后，置水平玻璃板上凝固，作為底層。

（2）另取冷卻至50℃左右的50ml LB培養(yǎng)基，加入1ml試驗(yàn)菌懸液，迅速搖勻后，用10ml破口吸管取6ml混菌培養(yǎng)基倒在底層平板上，作為菌層，并放置在水平玻璃板上凝固。

5. 在培養(yǎng)基平板底部作好相應(yīng)標(biāo)記，用彎頭鑷子在每個(gè)培養(yǎng)皿中等距離放入4個(gè)牛津杯。

6. 用滴管分別將高、低濃度的標(biāo)準(zhǔn)品和樣品溶液加入到牛津杯中，以滴滿為度，換上皿蓋。

7. 將培養(yǎng)皿平穩(wěn)送入恒溫箱，37℃下培養(yǎng)16～18h。

8. 用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑