實(shí)驗(yàn)?zāi)康?br />檢出和確認(rèn)各種正常和異常的血紅蛋白.
實(shí)驗(yàn)原理
根據(jù)不同的血紅蛋白帶有不同的電荷,等電點(diǎn)不同,在一定的pH緩沖液中,血紅蛋白的等電點(diǎn)小于緩沖液的pH時帶負(fù)電荷,電泳時在電場中向陽極泳動,反之,Hb帶正電荷向陰極泳動.在一定電壓下,經(jīng)過一定時間的電泳,不同的血紅蛋白所帶電荷不同,分子量不同,其泳動方向和速度不同,可分離出各自的區(qū)帶,同時對電泳出的各區(qū)帶進(jìn)行比色或電泳掃描,可進(jìn)行各種血紅蛋白的定量分析.一般zui常用的是pH8.6醋酸纖維薄膜電泳.
胞漿內(nèi)存在糖原或多糖類物質(zhì)（如粘多糖、粘蛋白、糖蛋白、糖脂等）中的乙二醇基（CHOH-CHOH）經(jīng)過碘酸（periodic acid）氧化,轉(zhuǎn)變?yōu)槎┗–HO-CHO）,與雪夫（Schiff ）試劑中的無色品紅結(jié)合,形成紫紅色染料而沉積于細(xì)胞內(nèi)多糖所在處.該反應(yīng)稱為過碘酸-雪夫（PAS）陽性反應(yīng),以前也稱為糖原染色.
實(shí)驗(yàn)方法
材料：
1. 緩沖液
（1）pH8.6 TEB緩沖液：稱取Tris10.29 g,EDTA 0.6 g,硼酸3.2 g,加蒸餾水至1000 ml.
（2）硼酸鹽緩沖液：稱取硼砂6.87 g,硼酸5.56 g,加蒸餾水至1000 ml.
2. 醋酸纖維薄膜、電泳儀、加樣器、分光光度計(jì)、比色杯.
方法：
1. 血紅蛋白溶液的制備
取肝素或者*抗凝血3 ml,2000 rpm離心10分鐘后棄去血漿；用生理鹽水洗滌紅細(xì)胞三次（750 rpm,離心5分鐘）,再2200 rpm,離心10分鐘,棄去上清液；加入等量的蒸餾水；再加入0.5倍體積四氯化碳,用力振搖5分鐘,2200 rpm,離心10分鐘后將上層Hb液吸出備用.
2. 浸膜
將醋酸纖維薄膜剪成3 cm×8 cm的紙條,浸入pH8.6 TEB緩沖液,浸透后取出,用濾紙吸干.
3. 點(diǎn)樣
用加樣器取血紅蛋白液10 µl,然后垂直點(diǎn)樣到醋酸纖維膜上（毛面）,距邊緣1.5 cm處.
4. 電泳
將硼酸鹽緩沖液作為電泳緩沖液倒入電泳槽中,將點(diǎn)樣后的醋酸纖維膜放于電泳槽架上,點(diǎn)樣在陰,200 V,30分鐘.
5. 洗脫
分別剪下HbA、HbA2,放入試管內(nèi),分別加入蒸餾水15 ml和3 ml,輕輕振蕩,待血紅蛋白*洗脫后,混勻.
6. 比色
洗脫液用蒸餾水空白調(diào)零,415 nm測定吸光度.
7. 計(jì)算
HbA2（%）=HbA2管吸光度/（HbA管吸光度×5+ HbA2管吸光度）×100%
實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算
pH8.6 TEB緩沖液醋酸纖維電泳參考范圍：HbA>95%,HbA2 1%-3.1%
注意事項(xiàng)
1. 電泳時間不能太長,電泳時醋纖膜不能變干,故應(yīng)觀察到HbA和HbA2清晰分開就停止電泳,電泳時間太長區(qū)帶反而擴(kuò)散模糊；
2. 點(diǎn)樣量不能太多,如血紅蛋白液太多,色帶易脫落或染色不透,可出現(xiàn)HbA相對增高的假陽性結(jié)果；
3. 避免醋酸纖維膜被蛋白質(zhì)污染；
4．電流不應(yīng)過大,否則血紅蛋白分不開帶；
5．應(yīng)同時做正常人和必要的已知異常血紅蛋白的標(biāo)本對照.