Sephadex G-25葡聚糖凝膠G-25

磷酸鹽緩沖液*碘汞蒸餾水磺基水楊酸溶液

錐形瓶量筒層析柱比色磁盤試管皮頭滴管

一、試劑與器材 
 

1.  Sephadex G-25。
 

2.  0.0175 mol/L，pH6.7磷酸鹽緩沖液。
 

3.  奈氏（Nessler）試劑：于500 ml錐形瓶內(nèi)加入*150 g，碘110 g，汞150 g及蒸餾水100 ml。用力振蕩7～15 min，至碘的棕色開始轉(zhuǎn)變時，混合液溫度升高，將此瓶浸于冷水內(nèi)繼續(xù)振蕩，直到棕色的碘轉(zhuǎn)變?yōu)閹ЬG色的*汞液為止。將上清液傾入2000 ml量筒內(nèi)，加蒸餾水至2000 ml，混勻備用。
 

4.  20%（W/V）磺基水楊酸溶液。
 

5.  1.5cm×20 cm層析柱。
 

6.  黑、白比色磁盤。
 

二、操作 
 

1.  取層析柱1支（1.5 cm×20 cm），垂直固定在支架上，關(guān)閉下端出口。將已經(jīng)溶脹好的Sephadex G-25中的水傾倒出去，加入2倍體積的0.0175 mol/L，pH6.7磷酸鹽緩沖液，并攪拌成懸浮液，然后灌注入柱，打開柱的下端出口，繼續(xù)加入攪勻的Sephadex G-25，使凝膠自然沉降高度到17 cm左右，關(guān)閉出口。待凝膠柱形成后，在洗脫瓶中加入0.0175 mol/L，pH6.7磷酸鹽緩沖液以3倍柱體積的磷酸鹽緩沖流過凝膠柱，以平衡凝膠。
 

2.  凝膠平衡后，用皮頭滴管除去凝膠柱面的溶液，將鹽析所得全部IgG樣品加到凝膠柱表面，打開柱下口，控制流速讓IgG樣品溶液慢慢浸入凝膠內(nèi)。凝膠柱面上加一層的0.0175 mol/L，pH6.7磷酸鹽緩沖液，并用此緩沖液洗脫，控制流速為0.5 ml/min左右。用試管收集洗脫液，每管10滴。
 

3.  在開始收集洗脫液的同時檢查蛋白質(zhì)是否已開始流出。為此，由每支收集管中取出1滴溶液置于黑色比色磁盤中，加入1滴20%磺基水楊酸，若呈現(xiàn)白色絮狀沉淀即證明已有蛋白質(zhì)出現(xiàn)，直到檢查不出白色沉淀時，停止收集洗脫液。
 

4.  由經(jīng)檢查含有蛋白質(zhì)的每管中，取1滴溶液，放置在白色比色盤孔中，加入1滴奈氏試劑，若呈現(xiàn)棕黃色沉淀說明它含有硫酸銨。合并檢查后不含硫酸銨的各管收集液，即為“脫鹽”后的IgG。
 

注意：在檢測時，用皮頭滴管吸取管中溶液后應(yīng)及時洗凈，再吸取下一管，以免造成相互污染假象。