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上海士鋒生物科技有限公司
中級(jí)會(huì)員 | 第14年

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標(biāo)準(zhǔn)品
培養(yǎng)基
培養(yǎng)基原料 霍亂弧菌診斷血清 大腸艾希氏菌診斷血清 志賀氏菌屬診斷血清 沙門氏菌屬診斷血清 標(biāo)準(zhǔn)血清,診斷血清 抗生素藥敏紙片 微生物配套試劑 微生物生化管 管裝培養(yǎng)基 即用型液體培養(yǎng)基 一次性培養(yǎng)基平板 顯色培養(yǎng)基 臨床培養(yǎng)基 菌種保存培養(yǎng)基 四環(huán)素檢定、厭氧亞硫酸鹽還原桿菌檢測(cè)培養(yǎng)基 維生素檢測(cè)培養(yǎng)基 一次性衛(wèi)生用品衛(wèi)生檢測(cè)培養(yǎng)基 罐頭食品商業(yè)無菌檢測(cè)培養(yǎng)基 飲用水及水源檢測(cè)培養(yǎng)基 藥品、生物制品檢測(cè)培養(yǎng)基 化妝品檢測(cè)培養(yǎng)基 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基 啤酒檢驗(yàn)培養(yǎng)基 軍團(tuán)菌檢測(cè)培養(yǎng)基 支原體檢測(cè)培養(yǎng)基 小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌檢驗(yàn)培養(yǎng)基 彎曲桿菌檢驗(yàn)培養(yǎng)基 產(chǎn)氣莢膜梭菌、肉毒梭菌、厭氧菌檢驗(yàn)培養(yǎng)基 阪崎腸桿菌檢驗(yàn)培養(yǎng)基 溶血性鏈球菌檢測(cè)培養(yǎng)基 李斯特氏菌檢測(cè)培養(yǎng)基 弧菌檢測(cè)培養(yǎng)基 乳酸菌、雙歧桿菌檢測(cè)培養(yǎng)基 酵母、霉菌檢測(cè)培養(yǎng)基 檢測(cè)培養(yǎng)基 沙門氏菌、志賀氏菌檢驗(yàn)培養(yǎng)基 大腸菌群、糞大腸菌群、大腸桿菌及腸桿菌科檢測(cè)培養(yǎng)基 細(xì)菌總數(shù)檢測(cè),增菌培養(yǎng)基
抗體
生物試劑
細(xì)胞
菌株
血清
細(xì)胞分離試劑
試劑盒

分子克隆常用載體

時(shí)間:2016/1/7閱讀:850
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DNA片段的克隆需要合適的載體,載體或是質(zhì)粒,或是噬菌體,或是病毒,通常大多經(jīng)過人工改造[地的。作為載體必須具備兩條件:一是該載體在細(xì)胞內(nèi)必須能自主復(fù)制,即必須具備復(fù)制原點(diǎn);二是該載體必須具備適合的酶切位點(diǎn),且這些酶切位點(diǎn)不在復(fù)制原點(diǎn)區(qū)域內(nèi)。以上兩條,保證了載體的可繁殖性和可利用性。為了便于獲得陽隆克隆,載體上常有篩選標(biāo)記,如對(duì)抗菌素的抗性,某些基因產(chǎn)物的顯色反應(yīng)等。

一、質(zhì)粒
常用的有pBR322,pUC系列質(zhì)粒等。
(一)pBR322質(zhì)粒是4362bp的環(huán)狀雙鏈DNA載體,有2個(gè)抗藥性基因(四環(huán)素和氨芐),一個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)和多個(gè)用于克隆的限制酶切點(diǎn)。當(dāng)缺失抗藥性基因的大腸桿菌被pBR322成功地轉(zhuǎn)化時(shí),它便從該質(zhì)粒獲得了抗生素抗性。兩個(gè)抗生素基因中均含供插入外源DNA用的不同的單一酶切位點(diǎn)。一般只選一個(gè)抗生素基因作為插入外源DNA之用。外源DNA插入后該抗生素抗性失活。另一抗生素抗性基因則作為轉(zhuǎn)化細(xì)菌后篩選陽性克隆之用。
(二)pUC系列質(zhì)粒是2.7Kb的雙鏈DNA質(zhì)粒,有一個(gè)復(fù)制起點(diǎn),一個(gè)氨芐抗性基因和一個(gè)多克隆位點(diǎn),多克隆位點(diǎn)處于表達(dá)LacZ基因產(chǎn)物-β-半乳糖苷酶的氨基端片段,用pUC質(zhì)粒轉(zhuǎn)化LacZ基因有突變的大腸桿菌株(M15)時(shí),因?yàn)橛少|(zhì)粒表達(dá)的α-肽補(bǔ)充了大腸桿菌卻失的α-肽,所以恢復(fù)了分解半乳糖的能力。在加入IPTG和X-gal的培養(yǎng)基上,長出藍(lán)色克隆。如果在多克隆位點(diǎn)內(nèi)插入外源DNA,由于它破壞了α-肽的表達(dá),因而在加入IPTG和X-gal的培養(yǎng)基,不能長出藍(lán)色克隆,這就是所謂的藍(lán)白篩選。

二、單鏈絲狀噬菌體和噬粒
(一)大腸桿菌絲狀噬菌體包括M13噬菌體f噬菌體等,其基因組均是單鏈閉環(huán)DNA分子,其中M13mp系列克隆載體是對(duì)野生型M13加以改造,插入了多克隆位點(diǎn)和LacZ基因后的載體,所以也是可以利用IPTG和X-gal作藍(lán)白篩選的,M13感染大腸桿菌后,即在菌體內(nèi)酶的作用下,以感染性單鏈DNA(正鏈)為模板,轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈DNA,稱作復(fù)制型DNA(RF DNA)。一般當(dāng)每一個(gè)細(xì)胞內(nèi)有100-200個(gè)RF DNA拷貝時(shí),即停止復(fù)制,產(chǎn)生有感染性的完整的單鏈絲狀噬菌體并分泌離開菌體。感染M13的大腸桿菌可繼續(xù)生長,并不發(fā)生裂解,但生長速度則較正常菌慢,取感染M13的細(xì)菌培養(yǎng)液離心,即可從菌體中提取RF DNA,供限制酶切割等分子克隆操作之用;從離心后的上清液中,可用聚乙二醇(PEG)沉出噬菌體顆粒,提取單鏈DNA(ss DNA)供DNA序列分析,體外定位突變等使用。
(二)噬粒(phagemid)在質(zhì)粒dna中插入一段單鏈?zhǔn)删w的復(fù)制起始點(diǎn)DNA,即構(gòu)成了噬粒,如pGEM-3Zf(-)就是一種噬粒。噬??上褚话阗|(zhì)粒一樣操作,但當(dāng)需要制備單鏈DNA時(shí),就需要在培養(yǎng)時(shí)加入輔助噬菌體,常用的輔助噬菌體有M13KO7和R408。培養(yǎng)好的菌液在離心除去菌體后,上清中加入PEG即可沉出含有單鏈DNA的顆粒。噬粒也常用于DNA序列分析和體外定位突變。分子克隆常用載體除了上述兩類以外,還有 噬菌體和粘粒,詳細(xì)情況可參閱有關(guān)資料。

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