一般培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板、培養(yǎng)皿的材質都是生物相容性的聚苯乙烯,且要求具有較好的光學性能。在加工成型后,要進行組織培養(yǎng)處理。各公司用的方法都不太一樣,而且這都是諱莫如深的商業(yè)秘密。其實不外乎兩種,一種是物理方法,即使培養(yǎng)細胞的那個面的粗糙度適合細胞粘附生長;第二種是化學方法,用季銨鹽、多肽或者血清、血漿等促進細胞粘附的物質涂覆表面。
在重復使用培養(yǎng)材料的時候,無論用什么方法洗,都會破壞這層很薄的處理層,使培養(yǎng)材料的生物相容性變差。如果這樣的話,我們冒著培養(yǎng)物被污染的危險,還不如使用玻璃培養(yǎng)瓶呢。
我為什么使用一次性細菌培養(yǎng)皿呢?其實這是國內供應商對這種培養(yǎng)皿的一個俗稱,應該從字面上翻譯成“一次性使用培養(yǎng)皿”,也就是“Disposable Petri Dish”。這是沒經過組織培養(yǎng)處理過的聚苯乙烯培養(yǎng)皿,買回后自己用聚賴氨酸、明膠、血清處理一下,滅菌后使用,效果不比細胞培養(yǎng)皿差,成本卻低了很多。尤其向大家以色列Mini Plast公司的一次性培養(yǎng)皿,Φ90的才8角錢一個,質量,比國產的同樣價格的強許多。
還有,可以買比利時Orange公司的培養(yǎng)瓶,價格只有Coring或Nunc的60%,我使用了一年,效果不比Nunc和Coring的差,而且是經過人體工學處理的,使用起來很順手。
其實DMEM細胞培養(yǎng)基的高糖和低糖對細胞培養(yǎng)影響并不大,我?guī)啄昵皠傞_始做細胞培養(yǎng)時也常為此困擾。如果為了保險起見,選高糖的好了。培養(yǎng)基中的、丙酮酸鈉濃度更重要,一定注意不同貨號培養(yǎng)基之間的細小差別,選組分全加入的貨號產品,畢竟省得不少另加試劑的開銷。HEPES的添加也很關鍵,尤其對代謝旺盛的細胞更是如此。選血清時,寧可買Hyclone公司的新生牛血清,也不要用國產胎牛血清,切記。經濟情況允許,建議用Hyclone的Define級血清,效果太好了。實際上國產胎牛血清都是新生牛,基本上都是病弱新生牛未哺乳前取的血,甚至不如進口新生牛血清,價格卻相差不多。國產血清太“臟”了,其中的內毒素、支原體等指標都達不到要求,zui近研究表明,內毒素是細胞凋亡的誘因之一。如果不做細胞因子和免疫相關的實驗,建議血清不要滅活,滅活后嚴重影響細胞生長速度,且細胞貼壁率降低。
Gibico的血清很好,我讀碩士時一直用。但是zui近兩年由于瘋牛病的原因(Gibico的血清不都產在美國和澳洲,也有瘋牛病發(fā)生的國家),進口的少,價格也貴。同一價格的前提下,畢竟Hyclone的Define級質量更好。Sigma的血清也很好,質量標準比Hyclone的還嚴格。具體選那種,還得根據(jù)您的工作性質而定,畢竟在國內科研經費有限,除非老板有上千萬的項目,可以不計實驗成本。
關于血清濃度和是否滅活,取決于您的具體實驗,并沒有嚴格的規(guī)定。一般原代細胞培養(yǎng)血清濃度稍高,我用20%,有利于提高細胞貼壁成活率,尤其是消化分離后沒有培養(yǎng)而直接凍存的細胞復蘇,就應該加25%血清。
如果做MTT實驗或類似的四唑鹽參與線粒體代謝的實驗,血清濃度盡可能低一些,一般5%-10%,可以減少血清對結果的干擾,尤其是采用水溶液法(如加10%SDS鹽酸溶解而不用DMSO)時更加重要。如果您做流式細胞分析,需要分析細胞周期,要經過一個“同步化”過程,有的學者用血清饑餓法,也就是24小時不加血清,使細胞周期趨于同步化。
我的細胞傳代原則:不用EDTA,只用,先用D-hank’s洗掉殘留培養(yǎng)基和血清,然后按1ml/10cm2培養(yǎng)面積加入,鏡下觀察,待到細胞回縮明顯且尚未脫壁時(這個過程不超過1分鐘),倒掉大部分,只保留細胞表面被少量濕潤,37度培養(yǎng)箱中放置5-15分鐘,直至細胞可象流沙狀下滑,加入含血清培養(yǎng)基終止消化,輕輕吹打使細胞散開,如有團塊,可考慮200目篩過濾,可不洗滌離心細胞。此種方法對細胞傷害zui小,如果做流式細胞分析,也可用此法,只不過在中加入等量EDTA溶液,出來的峰極規(guī)整漂亮。
某些細胞只用常規(guī)培養(yǎng)基不行,還必須補充生長因子或特殊量的氨基酸才能正常生長,要多參考相關文獻。
另外,二氧化碳張力和溫度也很重要,有些細胞需要較高的二氧化碳濃度或較特殊的溫度??蛇x用透氣蓋培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿培養(yǎng)板培養(yǎng)。