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上海士鋒生物科技有限公司
中級(jí)會(huì)員 | 第14年

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標(biāo)準(zhǔn)品
培養(yǎng)基
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RNA操作注意事項(xiàng)與實(shí)驗(yàn)技巧

時(shí)間:2017/6/26閱讀:892
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操作注意事項(xiàng):

  由于rna酶的廣泛存在與難以滅活的頑固特性。使得RNA的提取純化和后續(xù)工作變得非常困難。為了保證RNA的研究工作成功,請(qǐng)仔細(xì)閱讀下列注意事項(xiàng),相信它能幫助您解決常見的問(wèn)題。

  歸根究底,RNA工作的主要問(wèn)題是防止RNA酶的污染。RNA酶無(wú)處不在,在實(shí)驗(yàn)操作的任何一步,任何偶然的疏忽或不當(dāng)操作都有可能造成RNA酶污染,從而導(dǎo)致整個(gè)實(shí)驗(yàn)失敗。因此,嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件,避免任何可能的污染是保證實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵,必須做到以下幾點(diǎn):

 

1.如果可能,實(shí)驗(yàn)室應(yīng)辟出專門RNA操作區(qū),離心機(jī)、移液槍、試劑等均應(yīng)。RNA操作區(qū)應(yīng)保持清潔,并定期進(jìn)行消毒。

 

2.操作過(guò)程中應(yīng)自始至終佩戴拋棄式橡膠或乳膠手套,并經(jīng)常更換,以避免將手、臂上的細(xì)菌和真菌以及人體自身分泌的RNA酶帶入試管或污染用具。盡量避免使用拋棄式塑料手套。塑料手套不貼身,常常造成操作不便,而且多出部分還容易在器具上遭RNA酶污染并向未污染處傳遞,擴(kuò)大污染。

 

3.盡量使用一次性槍頭、離心管等塑料制品,盡量避免與其它實(shí)驗(yàn)共享器具,以防止交叉污染。使用出廠前已經(jīng)滅菌的槍頭和離心管,大多國(guó)外廠商供應(yīng)的無(wú)菌塑料制品很少有RNA酶污染,買來(lái)后可直接用于RNA操作。許多研究者用DEPC等處理的塑料制品,往往由于二次污染而帶有RNA酶,從而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗。

 

4.配制溶液用的酒精,異丙醇、Tris等應(yīng)采用未開封的新品。溶液需用DEPC水配制(加0.01%(體積比)DEPC至重蒸水或Mili Q級(jí)水中,處理過(guò)夜,滅菌即成DEPC水)。

 

5.所有玻璃制品都必須在240℃烘烤4小時(shí)。所有舊塑料制品都必須用0.5M的NaOH處理10分鐘,并用DEPC-H2O*沖洗后滅菌,也可考慮用0.01%的DEPC水浸泡過(guò)夜,然后滅菌,烘干。無(wú)法用DEPC處理的用具可以用氯擦拭若干次,這樣通??梢韵齊NA酶的活性。

 

樣本保存的注意事項(xiàng):

  樣本一旦從生物體中分離后,細(xì)胞內(nèi)的RNA就變得非常不穩(wěn)定,容易降解。因此取樣后,如何保證取樣前后基因的表達(dá)模式不變,就變得非常重要。傳統(tǒng)方法是用液氮速凍,再放到超低溫冰箱中保存。

 

  目前有些廠家開發(fā)出專門的RNA保護(hù)劑,如Qiagen公司的RNAlater是具有抑制RNase和穩(wěn)定RNA作用的試劑,將采集的組織樣本等直接放入到RNAlater中,即可起到穩(wěn)定樣本中RNA的作用。無(wú)需液氮或干冰,方便安全地在室溫下保存一段時(shí)間,低溫可保存。還有對(duì)細(xì)菌樣本的RNAprotect Bacteria Reagent及對(duì)血液樣本的PAXgene™ Blood RNA System。

 

RNA的定量與純度:

  RNA通常用分光光度計(jì)定量,測(cè)量在260 nm處的吸收值(A260)。通常分光光度計(jì)A260的讀數(shù)要介于0.15-1.0之間才是可靠的,因此RNA提取結(jié)束后,要根據(jù)大概產(chǎn)量稀釋(用10 mM Tris.HCl, pH 7.0稀釋)到適當(dāng)濃度范圍,再用分光光度計(jì)測(cè)量。A260為1相當(dāng)于RNA的濃度為40 µg/ml。

 

  為了檢測(cè)RNA的純度,可以測(cè)量A260與A280的比值,通常純RNA的A260/A280為1.9-2.1。

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