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標(biāo)準(zhǔn)品
培養(yǎng)基
培養(yǎng)基原料 霍亂弧菌診斷血清 大腸艾希氏菌診斷血清 志賀氏菌屬診斷血清 沙門氏菌屬診斷血清 標(biāo)準(zhǔn)血清,診斷血清 抗生素藥敏紙片 微生物配套試劑 微生物生化管 管裝培養(yǎng)基 即用型液體培養(yǎng)基 一次性培養(yǎng)基平板 顯色培養(yǎng)基 臨床培養(yǎng)基 菌種保存培養(yǎng)基 四環(huán)素檢定、厭氧亞硫酸鹽還原桿菌檢測培養(yǎng)基 維生素檢測培養(yǎng)基 一次性衛(wèi)生用品衛(wèi)生檢測培養(yǎng)基 罐頭食品商業(yè)無菌檢測培養(yǎng)基 飲用水及水源檢測培養(yǎng)基 藥品、生物制品檢測培養(yǎng)基 化妝品檢測培養(yǎng)基 動物細(xì)胞培養(yǎng)基 啤酒檢驗培養(yǎng)基 軍團菌檢測培養(yǎng)基 支原體檢測培養(yǎng)基 小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌檢驗培養(yǎng)基 彎曲桿菌檢驗培養(yǎng)基 產(chǎn)氣莢膜梭菌、肉毒梭菌、厭氧菌檢驗培養(yǎng)基 阪崎腸桿菌檢驗培養(yǎng)基 溶血性鏈球菌檢測培養(yǎng)基 李斯特氏菌檢測培養(yǎng)基 弧菌檢測培養(yǎng)基 乳酸菌、雙歧桿菌檢測培養(yǎng)基 酵母、霉菌檢測培養(yǎng)基 檢測培養(yǎng)基 沙門氏菌、志賀氏菌檢驗培養(yǎng)基 大腸菌群、糞大腸菌群、大腸桿菌及腸桿菌科檢測培養(yǎng)基 細(xì)菌總數(shù)檢測,增菌培養(yǎng)基
抗體
生物試劑
細(xì)胞
菌株
血清
細(xì)胞分離試劑
試劑盒

PCR技術(shù):樣品處理與注意事項

時間:2017/8/16閱讀:2236
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一、樣品處理
DNA是染色體的主要組成部分,是PCR的擴增模板。要進行PCR,研究DNA結(jié)構(gòu)與功能或者用于診斷目的,首先必須從生物體內(nèi)提取DNA。DNA往往以核蛋白形式存在,其分子量大(人的染色體DNA平均大小為3.0×109bp),提取DNA應(yīng)盡量保持DNA完整性和純度,即在提取中盡量避免機械張力引起的DNA分子降解,又要注意雜質(zhì)及蛋白的去除,防止胞內(nèi)酶解DNA。因此,提取DNA的基本過程是:用Proteinase K及SDS,在EDTA存在下,裂解細(xì)胞,消化蛋白質(zhì),使核蛋白解聚及胞內(nèi)DNA酶失活,然后用酚/多次提取去除蛋白質(zhì),在DNA中若混有少量RNA,可用RNase去除,zui后用乙醇沉淀得到DNA。

理論上PCR對模板DNA純度及完整性要求并不高,細(xì)胞經(jīng)過熱變性使DNA釋出就可以作為模板,依賴引物的選擇性進行擴增。這對拷貝數(shù)很多的基因組,確實如此。但當(dāng)待擴增的拷貝數(shù)甚少而無關(guān)細(xì)胞甚多時則擴增就不易成功,其原因是:①非希望的擴增增多,掩蓋了所需擴增的片段,使其數(shù)量減少至不能檢測到的程度。②生物樣品中的雜質(zhì)會抑制pcr反應(yīng),zui主要的是血液和瓊脂糖。例如在100μl反應(yīng)液中加入1μl全血就可引起抑制,0.8μmol/L的血紅素也會引起明顯的抑制。對于含血液的樣品,可以用滲透壓溶解紅細(xì)胞,離心集取細(xì)胞核,洗除血紅蛋白,再用蛋白酶/表面活性劑處理的方法來解決。另一簡單的方法是煮沸之,使釋放DNA,并沉淀Hb,用上清液作PCR。

現(xiàn)將PCR前處理各種標(biāo)本的基本方法介紹如下:

1.所需溶液

(1)PBS 0.85% W/V NaCl,66mmol/L Na3PO4 pH7.0

(2)含表面活性劑及蛋白酶k的PCR緩沖液

50mmol/L KCl, 10mmol/L Tris-HCl(pH8.3) 2.5mmol/L MgCl2

0.1mg/ml明膠,0.45%NP40,0.45%吐溫20

高壓滅菌,冷凍儲存。臨用前加0.6μl的10mg/ml蛋白酶K(水溶液)至100μl溶液中。

(3)溶血緩沖液

0.32mol/L蔗糖,10mmol/L Tris-HCl pH7.5

5mmol/L MgCl2,1% Triton X-100

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