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標(biāo)準(zhǔn)品
培養(yǎng)基
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生物試劑
細(xì)胞
菌株
血清
細(xì)胞分離試劑
試劑盒

PCR技術(shù):樣品處理與注意事項

時間:2017/8/16閱讀:2236
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一、樣品處理
DNA是染色體的主要組成部分,是PCR的擴增模板。要進行PCR,研究DNA結(jié)構(gòu)與功能或者用于診斷目的,首先必須從生物體內(nèi)提取DNA。DNA往往以核蛋白形式存在,其分子量大(人的染色體DNA平均大小為3.0×109bp),提取DNA應(yīng)盡量保持DNA完整性和純度,即在提取中盡量避免機械張力引起的DNA分子降解,又要注意雜質(zhì)及蛋白的去除,防止胞內(nèi)酶解DNA。因此,提取DNA的基本過程是:用Proteinase K及SDS,在EDTA存在下,裂解細(xì)胞,消化蛋白質(zhì),使核蛋白解聚及胞內(nèi)DNA酶失活,然后用酚/多次提取去除蛋白質(zhì),在DNA中若混有少量RNA,可用RNase去除,zui后用乙醇沉淀得到DNA。

理論上PCR對模板DNA純度及完整性要求并不高,細(xì)胞經(jīng)過熱變性使DNA釋出就可以作為模板,依賴引物的選擇性進行擴增。這對拷貝數(shù)很多的基因組,確實如此。但當(dāng)待擴增的拷貝數(shù)甚少而無關(guān)細(xì)胞甚多時則擴增就不易成功,其原因是:①非希望的擴增增多,掩蓋了所需擴增的片段,使其數(shù)量減少至不能檢測到的程度。②生物樣品中的雜質(zhì)會抑制pcr反應(yīng),zui主要的是血液和瓊脂糖。例如在100μl反應(yīng)液中加入1μl全血就可引起抑制,0.8μmol/L的血紅素也會引起明顯的抑制。對于含血液的樣品,可以用滲透壓溶解紅細(xì)胞,離心集取細(xì)胞核,洗除血紅蛋白,再用蛋白酶/表面活性劑處理的方法來解決。另一簡單的方法是煮沸之,使釋放DNA,并沉淀Hb,用上清液作PCR。

現(xiàn)將PCR前處理各種標(biāo)本的基本方法介紹如下:

1.所需溶液

(1)PBS 0.85% W/V NaCl,66mmol/L Na3PO4 pH7.0

(2)含表面活性劑及蛋白酶k的PCR緩沖液

50mmol/L KCl, 10mmol/L Tris-HCl(pH8.3) 2.5mmol/L MgCl2

0.1mg/ml明膠,0.45%NP40,0.45%吐溫20

高壓滅菌,冷凍儲存。臨用前加0.6μl的10mg/ml蛋白酶K(水溶液)至100μl溶液中。

(3)溶血緩沖液

0.32mol/L蔗糖,10mmol/L Tris-HCl pH7.5

5mmol/L MgCl2,1% Triton X-100

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