一、膠回收的關(guān)鍵參數(shù)

膠回收的質(zhì)量直接影響后繼實(shí)驗(yàn)的成功與否。要想做好膠回收，無論是自己親力親為還是借助目前五花八門的膠回收試劑，zui基本的評定標(biāo)準(zhǔn)無外乎這么幾個(gè):質(zhì)量( 回收產(chǎn)物的純度和濃度)，回收效率，操作方便(速度)，柱子的載量等等。

回收產(chǎn)物質(zhì)量：回收產(chǎn)物的質(zhì)量主要指純度。常規(guī)電泳過程中，普通級別的瓊脂糖自帶的一些性狀不明的多糖，會(huì)連同DNA一起從凝膠中抽提出來，會(huì)強(qiáng)烈抑制后繼的連接、酶切、或者標(biāo)記、擴(kuò)增等實(shí)驗(yàn)。從凝膠中回收DNA片斷，產(chǎn)物的純度自然是我們考慮的*要?jiǎng)?wù)。對于大片斷DNA回收，質(zhì)量還包括了產(chǎn)物的完整與否，如果機(jī)械剪切力使得回收產(chǎn)物大小不一致，后果決不是你希望碰見的。而對于較小片斷回收，質(zhì)量其實(shí)還包括了回收產(chǎn)物的濃度。因?yàn)楫a(chǎn)物濃度太小，對后繼實(shí)驗(yàn)同樣也有影響，比如連接、標(biāo)記實(shí)驗(yàn)等等就很不爽，往往不得不再濃縮一次，增加了操作的復(fù)雜性。此外，極微量的純化介質(zhì)或者是某些試劑混入回收產(chǎn)物中也會(huì)對結(jié)果產(chǎn)生致命的影響。

回收率：回收得率，是我們考慮的另一個(gè)重要參數(shù)。由于上電泳的樣品量通常都很少，電泳的過程本身也會(huì)導(dǎo)致樣品的分散和損失，因而盡可能多的回收電泳凝膠條帶中的目的片斷，提高產(chǎn)物得率，對于后繼實(shí)驗(yàn)來說是非常重要的。回收率的多少通常和回收產(chǎn)物的大小以及量的多少有關(guān)，比如DNA片斷越大，和固相基質(zhì)的結(jié)合力越強(qiáng)，就越難洗脫，回收率就低;又比如說，DNA的量越少，相對損失越大，回收率越低。因此，根據(jù)情況選擇不同的方法是很重要的。值得注意的是，由于樣品的大小和多少對回收率都有顯著的影響，所以回收率并非是一成不變的。

其他：操作方面，相信大家都會(huì)比較喜歡操作簡單，快速，應(yīng)用起來方便的方法或者產(chǎn)品。比如溶膠的緩沖液中添加指示劑，可以指示溶膠的溶液pH值就是很方便的設(shè)計(jì);離心過柱就比離心沉淀要簡單方便。載量，就是每次回收zui多能回收的產(chǎn)物的量。這個(gè)自然是越大越好了，因?yàn)閷τ诩兓蛘咭欢康募兓橘|(zhì)，過量的產(chǎn)物吸附不了就是被浪費(fèi)掉的。難免有時(shí)你需要回收比較大量的產(chǎn)物，大載量就很有優(yōu)勢——同一個(gè)片斷你要用2個(gè)柱子，多郁悶啊。

二：膠回收方法和分類

20世紀(jì)70年代是一個(gè)奠定現(xiàn)代分子生物學(xué)的時(shí)代，1973年冷泉港實(shí)驗(yàn)室的Joseph Sambrook和Phillip Sharp發(fā)明了利用瓊脂糖凝膠分離DNA和EB染料觀測DNA相結(jié)合的技術(shù)。現(xiàn)在，瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠電泳是分離、鑒定和純化核酸和蛋白質(zhì)片斷的標(biāo)準(zhǔn)方法。生物通將在后面另文討論聚丙烯酰胺凝膠電泳片斷

回收的方法，這里首先介紹的是瓊脂糖凝膠電泳片斷回收的常用方法：

1.柱回收試劑盒：可謂目前zui簡單快速的回收方法，只需要將電泳凝膠中的產(chǎn)物條帶切下，用溶解Buffer*溶解，上包埋有純化填料的純化柱，離心，再洗滌一次，離心后用洗脫緩沖液洗脫。全程不過10多分鐘，得到的產(chǎn)物溶液可以直接用于后繼實(shí)驗(yàn)。這個(gè)方法幾乎不需要什么技巧就能得到穩(wěn)定的結(jié)果，也是目前zui多商品化試劑盒選擇的方法。但是這個(gè)方法不適合用于大片斷的回收。

2.玻璃奶/純化填料膠回收試劑盒：這個(gè)方法比前面的方法更為靈活，可以根據(jù)每次回收實(shí)驗(yàn)時(shí)預(yù)期回收量來調(diào)整純化填料的量，使得實(shí)驗(yàn)不受限于柱子的載量，也不會(huì)造成浪費(fèi)。前面的操作步驟和上者一樣，將電泳凝膠的條帶切下，Buffer溶解，(區(qū)別在于這里)加入純化填料填料吸附混合，快速離心沉淀去上清，洗滌沉淀后，干燥沉淀，zui后用洗脫液純化介質(zhì)中吸附的片斷釋放出來，離心，取上清，就是回收的產(chǎn)物。這個(gè)方法適合各種不同大小的片斷，特別是大片斷的回收，但是操作就較前者復(fù)雜一些，涉及到多次離心沉淀和取上清，有可能會(huì)誤吸了微量的沉淀;另外干燥的程度也有點(diǎn)技巧，干過了不好洗脫，沒干透又影響結(jié)果。后來的改進(jìn)版本有將混合了純化介質(zhì)后的凝膠溶解液加入到一種離心過濾柱上，這種柱子不帶純化填料，只有一層過濾膜，離心過濾后，填料在柱子里，溶液被甩掉，這樣就避免了上述的問題。

3.低熔點(diǎn)瓊脂糖：傳統(tǒng)手工操作方法之一，低熔點(diǎn)瓊脂糖制備凝膠，電泳后切割目的條帶，在TE溶液中65度保溫融化，用傳統(tǒng)的酚氯仿抽提，乙醇沉淀。這個(gè)方法需要用到酚氯仿等有機(jī)試劑，由于乙醇沉淀需時(shí)較長，現(xiàn)在用的人已經(jīng)不多了。想當(dāng)年經(jīng)費(fèi)緊張的時(shí)候，低熔點(diǎn)瓊脂糖貴，不舍得這么浪費(fèi)的，比較取巧省錢的法子就是常規(guī)瓊脂糖電泳后，在目的條帶前方挖槽，灌入低熔點(diǎn)瓊脂糖，凝膠后再電泳一小會(huì)兒，等條帶進(jìn)入低熔點(diǎn)瓊脂糖區(qū)域再將那塊家伙切出來，就可以非常非常節(jié)約了。除了直接酚抽低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠，還有人用瓊脂糖酶來消化瓊脂糖凝膠，條件也相當(dāng)溫和，只是那酶價(jià)格并不便宜(光那酶的成本就少5-6塊，還不算其他的麻煩事)，多數(shù)的酶只適合用低熔點(diǎn)瓊脂糖，問題是我不用酶也可以直接酚抽，費(fèi)時(shí)間還特長，所以，并不覺得特別好用。后來據(jù)說T家的瓊脂糖酶可以用于常規(guī)瓊脂糖，前提是你有辦法在65度把那膠化了。但那需要*的耐心。我們后面會(huì)有介紹。后來有老師從美國回來了，才有機(jī)會(huì)嘗試更好的低熔點(diǎn)瓊脂糖——FMC(現(xiàn)在叫做Cambrex了)的GTG級別低熔點(diǎn)瓊脂糖!那才是zui簡單的方法呀!洗的超級干凈的電泳槽灌膠，電泳后，直接將條帶切下65度保溫融化，就可以直接在融化的瓊脂糖—DNA混合物中加酶進(jìn)行后繼實(shí)驗(yàn)——所謂的GTG就是遺傳技術(shù)級，可以在凝膠中進(jìn)行各種酶反應(yīng)的哦!實(shí)驗(yàn)條件非常溫和，非常適合大片斷的回收。

4.透析帶電洗脫法。煩，簡直不堪回首。切下的條帶放在充滿TAE的透析帶中再電泳一段時(shí)間，讓DNA走出凝膠，走向溶液中，再反向電泳一會(huì)兒，將附在透析帶上的DNA趕回溶液中，取溶液部分，再用TAE洗洗袋子，合并溶液后傳統(tǒng)方法酚抽沉淀，那塊膠通常還要再染色看看殘留。由于綁透析帶非常難搞，只有在萬不得已的非常大的片斷時(shí)才會(huì)考慮的。也是丙烯酰胺電泳凝膠產(chǎn)物回收的方法之一。后來看到以色列的一個(gè)小公司GeBA有出簡易透析管(生物通早在02年就有新技術(shù)專欄文章介紹的)，就是將小指管兩邊各開一小窗，貼上透析膜，把膠塊放在管中再電泳。由于不需要綁透析帶，使用方便;而且管中溶液體積小，容易處理;膜的面積也小吸附也少;頓時(shí)覺得是救星。后來貌似Pierce也推出了類似的東西，買起來更方便一點(diǎn)。

5.DEAE纖維素膜紙片法和其他改良法。早期實(shí)驗(yàn)室zui常用方法之一。將DEAE纖維素膜裁成小條活化處理。電泳后在目的條帶前切一刀，將比條帶略寬的DEAE纖維素膜插入切口，不留氣泡，繼續(xù)電泳一會(huì)兒，條帶上的DNA被膜片截留，取出膜片沖洗后轉(zhuǎn)移到離心管中加緩沖液65度保溫洗脫，直到膜上沒有DNA了，將溶液用酚氯仿抽提沉淀。這個(gè)方法不適合做較大的DNA，因?yàn)橄疵摫容^困難。曾經(jīng)常用的另一方法是在電泳膠前挖小槽，加入緩沖液，電泳一小會(huì)兒，手提紫外監(jiān)視，等條帶進(jìn)入槽中，還沒在另一頭上岸時(shí)停止電泳，吸出溶液酚氯仿抽提(加點(diǎn)甘油可降低DNA在溶液中的移動(dòng)速度，防止那邊還沒全部下水，這邊就已經(jīng)上岸了的情況。當(dāng)然也可以挖大點(diǎn)的孔或者多吸幾次，反正是要沉淀的，體積大些不要緊)。不過這些方法在柱回收試劑盒推出后都漸漸要淘汰了。畢竟比較麻煩費(fèi)時(shí)間，而且回收的產(chǎn)物純度也不比試劑盒——前者是純化介質(zhì)吸附DNA后*除去溶液，經(jīng)過洗滌殘留在純化介質(zhì)上的雜質(zhì)，zui后洗脫;手工的方法多是用酚氯仿抽提溶液后乙醇沉淀，由于有些多糖沉淀屬性和DNA相似時(shí)就容易共沉淀下來。鑒于競爭的日趨激烈,純化試劑價(jià)格逐漸向下,連核酸純化領(lǐng)域的*Qiagen也開始大幅度的折扣優(yōu)惠,所以,有條件還是選擇試劑盒,比自己慢慢摸索要更能節(jié)約寶貴的青春。所以，這里準(zhǔn)備將回收片斷按照大小不同來分別介紹不同用途的產(chǎn)品：

常規(guī)片斷級(DNA片段為100bp-10kb)：主流方法是柱回收試劑盒

大片段級(DNA片段>7kb)：可選方法是玻璃奶/純化填料膠回收試劑盒，電洗脫

小片段級(DNA片段<100bp)：柱回收試劑盒

三、常規(guī)片斷級的選擇指南：所謂常規(guī)級，即回收片段大小介于100bp和10kb之間，在這個(gè)范疇內(nèi)包含了

一般的質(zhì)?；蛘呖寺∑蔚幕厥?。主流方法是柱回收試劑盒。

1. Qiaquick Gel Extraction Kit

品牌：Qiagen

回收范圍：70bp-10kb

指數(shù)：

價(jià)格指數(shù)：(50包裝1,350，250包裝6,372，約27元/反應(yīng)，現(xiàn)有半價(jià)活動(dòng)，價(jià)格非常

可親!)

特點(diǎn)：

. 高達(dá)80%回收率

. 操作快速簡單，3步完成70bp-10kb片段的回收

. 提供三色指示劑的電泳上樣loading Buffer,方便判斷和操作

. 回收產(chǎn)物純度高，可用于同位素或熒光測序、芯片分析、連接轉(zhuǎn)化、酶切、標(biāo)記、PCR、顯微注

射、體外轉(zhuǎn)錄等后繼實(shí)驗(yàn)

使用心得：

Qiaquickzui引以為傲的就是非常穩(wěn)定的質(zhì)量，高回收率和方便的步驟。產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定可靠，一向是實(shí)驗(yàn)首要條件。畢竟，實(shí)驗(yàn)步驟是環(huán)環(huán)相扣的，每一步出現(xiàn)問題都會(huì)導(dǎo)致后患無窮，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，還更費(fèi)錢，對心情更是一種折磨。用試劑盒不就圖省事和可靠嗎?從核酸純化領(lǐng)域起步的Qiagen，在實(shí)驗(yàn)室都享有*的口碑，是值得信賴的選擇。因?yàn)镼iagen有強(qiáng)大的研發(fā)隊(duì)伍，精益求精優(yōu)化實(shí)驗(yàn)操作的每一環(huán)節(jié)，絕非普通臨摹制品、仿制品可比。以回收率為例，我們前面提到，由于樣品的大小和多少對回收率都有顯著的影響，所以回收率并非是一成不變的。所以Qiagen以嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膽B(tài)度提供多種條件下的詳細(xì)介紹：使用QIAquick回收之前和回收之后再混合的DNA片段 (大小已指出) 。對所有尺寸的片段均獲得了接近80%的回收率。

A 1–5: 回收之前; P: 回收之后再混合。樣品使用 1.5% 瓊脂糖凝膠分析(TAE buffer)。

B 1–3: 回收之前; P: 回收之后混合。樣品于 3.5% 高分辨瓊脂糖凝膠上分析( TAE buffer)。M: pTZ-HinfI marker。

記得《分子克隆II》里曾經(jīng)說少于500ng的DNA幾乎沒有回收價(jià)值，看看上表就可以發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)在的技術(shù)發(fā)展，即使是少到100ng的DNA還有70%的回收率呢!而且操作方法還很簡單。雖然是幾乎不需要實(shí)驗(yàn)技巧的簡單操作，如果你注意到一些小技巧 還是很有幫助的。DNA回收純度取決于純化介質(zhì)對DNA吸附的特異性、洗滌雜質(zhì)是否*。而DNA回收率和濃度則與elution buffer的體積，以及buffer在柱子上停留的時(shí)間有關(guān)。較大的洗脫體積可以提高回收率，充分洗脫，但是會(huì)造成產(chǎn)物濃度太低不好用。比如100-200ul的洗脫液可以*洗脫純化柱吸附的DNA，不過考慮到后繼實(shí)驗(yàn)的方便，Qiaquick建議使用50ul的洗滌液，正對加入膜(避免加在管壁上而不能充分接觸純化介質(zhì))，可以*浸潤回收柱上的純化膜。zui低建議采用30ul洗脫液，但是可能會(huì)降低回收率。有人試過用15—25ul洗脫2次，覺得這樣*次濃度高第二次比較充分，其實(shí)沒有必要，只要適當(dāng)延長在柱上停留的時(shí)間，就有助于提高得率——Qiagen的Protocol說明，30ul停留1分鐘要比50ul停留1分鐘回收濃度高1.7倍。充分離心(保證速度和時(shí)間)有助于提高得率和純度，減少殘留對后繼實(shí)驗(yàn)的影響(這個(gè)方法要注意不是所有試劑盒都可以使用，因?yàn)橛行┰噭┖械募兓盍纤梢恍?，離心有時(shí)可能導(dǎo)致少量填料脫落，而Qiagen的這個(gè)產(chǎn)品是膜式的，結(jié)合非常牢固，據(jù)生物通線報(bào)，中大有人用這個(gè)柱子高溫消毒后重復(fù)使用，效果不賴，可見皮實(shí)。當(dāng)然這是廠家不的)。其他的技巧也是大家熟知的，比如切膠的時(shí)候要盡量減少切膠體積(不超過400mg)，由于Qiaquick柱子的載量達(dá)到10ug，如果膠塊實(shí)在太大而預(yù)期DNA總量不超過10ug，可以用大一點(diǎn)的管溶解，分幾次上柱離心吸附后再洗滌。注意的是紫外照射時(shí)間不要太長，因?yàn)樽贤饩€對DNA(特別是對于較大的片段)有影響。還有就是溶膠要*，用槍頭把膠塊弄碎一點(diǎn)有助于50度下快速溶解。溶解*后溶液的顏色指示溶液的pH值，如果變色需要調(diào)pH值以防止實(shí)驗(yàn)失敗。需要用ddH2O或者TE洗脫的，注意pH在7.0—8.5之間的回收率zui高?；厥章屎推瑪啻笮　⒍嗌儆嘘P(guān)，較大的片斷(7kb以上)回收率會(huì)有所降低，洗脫液預(yù)熱到50度再加入純化柱膜，有助于提高產(chǎn)率。除了比較適合個(gè)人使用的傳統(tǒng)離心式，Qiagen還提供抽濾式的膠回收試劑盒，用抽濾的方法替代離心，使得實(shí)驗(yàn)可以連續(xù)進(jìn)行，特別適合批量進(jìn)行的需要——想象看，你只要將溶膠液加入裝配好的抽濾管中，嘩一下就抽干了，再加洗滌的試劑，嘩一下又好了，多快呀!節(jié)約很多時(shí)間和功夫，不需要在離心機(jī)前面拿進(jìn)拿出。以后的全自動(dòng)操作模式就是這樣的啦!

看到這里可能大家都會(huì)說Qiagen的東西好是好，但是就是貴，一般的實(shí)驗(yàn)室都舍不得平時(shí)用，往往留著關(guān)鍵時(shí)刻做，不錯(cuò)，好東西自然不便宜，不過想要吃到便宜的午餐也不是不可能.

2.MinElute Gel Extraction Kit

品牌：Qiagen

回收范圍：70bp-4kb

指數(shù)：

價(jià)格指數(shù)：(50包裝1,485，約29元/反應(yīng)，現(xiàn)生物通有半價(jià)活動(dòng)哦)

特點(diǎn)：

. 洗滌體積只要10ul，回收產(chǎn)物濃度高，方便后繼實(shí)驗(yàn)

. 使用方便快捷(wash-and-spin)

. 高回收率

. 回收產(chǎn)物純度高，可用于同位素或熒光測序、芯片分析、連接轉(zhuǎn)化、酶切、標(biāo)記、PCR、顯微注

射、體外轉(zhuǎn)錄等后繼實(shí)驗(yàn)

使用心得：

如果要回收片斷量本來就很少，比如只有幾十個(gè)ng，用常規(guī)的試劑盒洗脫得到將近50ul的產(chǎn)物，連接反應(yīng)就很難做——要不體積很大，要不會(huì)覺得濃度太低。如果是用來做顯微注射、標(biāo)記等實(shí)驗(yàn)就更難受，只能再濃縮一次，不但麻煩，多一次操作也會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)物進(jìn)一步的損耗。這一點(diǎn)，就是快速的柱回收試劑盒比傳統(tǒng)方法不如的地方，因?yàn)閭鹘y(tǒng)方法得到沉淀后可以按照需要溶解得到自己需要的濃度，柱回收就不行。MinElute就是為這個(gè)需要而誕生的。MinElute膠回收試劑盒是基于一種特殊的Silica gel menbrane的膜技術(shù)，能在高鹽濃度的條件下迅速吸附DNA，在低鹽或者純水條件下釋放DNA，只要短短幾分鐘，就能*除去包括引物、核苷酸、酶、礦物油、鹽、瓊脂糖、EB以及其它雜質(zhì)，和以前QIAGEN的Silica gel menbrane有所不同的是，它要求的洗脫體積非常小，只要10ul(當(dāng)然這更要注意讓洗脫液加在膜上)，純化的DNA是高度濃縮的，回收率在80%以上。這樣就非常適合用于后繼實(shí)驗(yàn)操作，不需要再濃縮一次。MinElute為了確保高質(zhì)量和高回收率，利用了特殊的binding buffer，這種緩沖液是特別設(shè)計(jì)和優(yōu)化了的，可以增加DNA分子特異性吸收，減少雜質(zhì)，不過也帶來了一個(gè)問題，那就是導(dǎo)致MinElute的DNA吸附范圍是70bp到4kb，而不是以往的10kb，因此4kb以上的只能用Qiagen的Qiaquick或其它產(chǎn)品了，而10kb以上就該用QIAEX II系列。此外MinElute柱子的載量是5ug，畢竟洗脫體積這么小。體積小則小矣，可是質(zhì)量并不含糊，回收的產(chǎn)物可以用于PCR、克隆、標(biāo)記、測序、體外轉(zhuǎn)錄等后繼實(shí)驗(yàn)，也同樣可以用于顯微注射、芯片分析等要求非常嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)。你盡管可以說，我又不需要做那些嚴(yán)格實(shí)驗(yàn)，我就克隆PCR什么的就夠了，哪兒要那么純——然而你也不能否認(rèn)這本來就是一種質(zhì)量可靠的信心保證。特別是當(dāng)遇到*活動(dòng)的時(shí)候，你還猶豫什么呢。除了以上幾個(gè)方面，MinElute系列產(chǎn)品正如Qiagen其它產(chǎn)品一樣：講究，注重細(xì)節(jié)品質(zhì)。MinElute有三種上樣Buffer染料顏色(青、藍(lán)和黃)，方便樣品分析，并且也包含pH目測指示染料，可以在溶膠的時(shí)候幫助指示實(shí)驗(yàn)錯(cuò)誤(pH值對膠回收影響較大，見下)——錯(cuò)誤的顏色代表了凝膠Buffer重復(fù)使用等實(shí)驗(yàn)配置不當(dāng)導(dǎo)致的不正確化合物，這種情況可通過醋酸鈉進(jìn)行調(diào)整。

3. Promega Wizard SV Gel and PCR Clean-up System

品牌：Promega

回收范圍：100bp-10kb

指數(shù)：

價(jià)格指數(shù)：(50次包裝的試劑盒報(bào)價(jià)為562元，11元/次，折扣前)

Promega的產(chǎn)品在進(jìn)口品牌中一向以價(jià)格可親而著稱。這個(gè)膠回收試劑盒也不例外。并且驚喜的發(fā)現(xiàn)這個(gè)試劑盒的性能參數(shù)好得令人刮目相看!首先是100bp—10kb的回收率高達(dá)80%—95%(用于PCR產(chǎn)物回收時(shí)適用于100bp—3.2kb的片斷);然后是每個(gè)柱子的載量高達(dá)40ug!低至10ng?？梢匀菁{更多的DNA，滿足一次大量片斷回收的需求。另外，試劑盒的洗脫體積是50ul，但是如果需要濃度高的回收產(chǎn)物，也可以用不少于15ul的純水洗脫，而且回收率也不會(huì)有太大的影響。回收產(chǎn)物可用于測序、克隆、標(biāo)記、酶切、體外轉(zhuǎn)錄和芯片分析等后繼實(shí)驗(yàn)。操作也同樣非常簡單，無非是溶膠吸附、洗滌柱子，zui后洗脫。這樣，一個(gè)試劑盒兼具了多種優(yōu)點(diǎn)，加上價(jià)格相宜，實(shí)在是進(jìn)口產(chǎn)品中的性價(jià)比*。特別是大到9kb的片斷，回收率可以達(dá)到95%是難得的。這個(gè)試劑盒使用中值得注意的幾個(gè)小技巧，比如如果凝膠體積大于350mg，可以分次離心(一個(gè)柱子zui多可以過相當(dāng)于3.5g凝膠!就是吸附10次!)，而且離心前要讓溶膠液在柱子上靜置1分鐘讓其充分吸附。對于超過5kb的片斷，溶膠的時(shí)候不要振蕩，膠較濃的時(shí)候溶膠時(shí)間要延長保證充分溶解。洗滌2次有助于得到更干凈的產(chǎn)物。

4、Montage Gel Extraction Kit

品牌：Millipore

回收范圍：100bp-10kb

指數(shù)：

價(jià)格指數(shù)：

特點(diǎn)：

. 時(shí)間短：10分鐘spin

. DNA保存完整

. 試劑盒包括做為過濾裝置的凝膠噴霧器(nbulizer)、離心瓶和TAE gel extraction buffer

使用心得：

這一款膠回收試劑盒不同于之前提到的凝膠回收方法——Montage利用的是從凝膠中抽取(compression)DNA片段的方法：通過離心力解離凝膠的結(jié)構(gòu)，驅(qū)使瓊脂糖在gel nebulizer中穿過小孔，這樣形成的膠泥就被甩進(jìn)樣品過濾蓋中。因此無需其它多余的操作，直接將切下來的凝膠放進(jìn)去，經(jīng)過5000g/10min，即可得到回收DNA片段(見下)。

回收率見下：

Typical DNA Recoveries from Agarose Gels

DNA Size (bp)

Percent DNA Recoveries

100

78

700

71

1000

77

2027

47

4361

35

9416

32

23130

29

Millipore的膜技術(shù)使得Millipore純化系列其實(shí)在自動(dòng)化高通量領(lǐng)域有相當(dāng)好的口碑，價(jià)格實(shí)惠質(zhì)量可靠。

4.經(jīng)濟(jì)實(shí)惠的國產(chǎn)之選

在普通級膠回收中應(yīng)該提及的是一些國產(chǎn)品牌，畢竟在現(xiàn)今膠回收技術(shù)成熟并得到了廣泛應(yīng)用的基礎(chǔ)上，一些國產(chǎn)品牌也提供了經(jīng)濟(jì)實(shí)惠的膠回收試劑盒，比如天根，杭州維特潔，深圳天地人，等等。低廉的價(jià)格，使得平時(shí)用起來也揮灑自如不心疼，如果說進(jìn)口產(chǎn)品打開的實(shí)驗(yàn)自由化之門，那么跟進(jìn)的國產(chǎn)產(chǎn)品則實(shí)實(shí)在在讓國內(nèi)科研經(jīng)費(fèi)緊張的實(shí)驗(yàn)室也能分享簡化實(shí)驗(yàn)的快樂，窮人的孩子也有春天。在國內(nèi)，價(jià)格還是zui有殺傷力的。天為時(shí)代已經(jīng)被Qiagen收購并改名天根，而在國產(chǎn)品牌中口碑很好的維特潔也被Axygen收購。生物通在這里列舉了部分國產(chǎn)產(chǎn)品的對比，當(dāng)然，要注意參數(shù)是廠家提供的，標(biāo)準(zhǔn)有差別的。

品牌

天根(天為時(shí)代)杭州維特潔(已被Axygen收購)深圳天地人Omega

產(chǎn)品

普通瓊脂糖凝膠回收試劑盒

AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒小量膠回收試劑盒瓊脂糖凝膠回收試劑盒

回收片段大小

100bp-10kb

75bp-10kb

50bp-20kb

回收率

>80%(100 bp的

DNA片段回收率為

50 %以上)

60—85%(根據(jù)長度不

同)

85%

產(chǎn)品描述

可以、專一結(jié)合DNA的硅基質(zhì)材料和*的緩沖液系統(tǒng)，從TAE或TBE瓊脂糖凝膠上回收DNA片段，同時(shí)除去蛋白質(zhì)、其它有機(jī)化合物、無機(jī)鹽離子及寡核苷酸引物等雜質(zhì)。采用優(yōu)化的試劑和方便的DNA制備管，適合從各種電泳凝膠(TAE或TBE)中提取多至8 ug線性DNA。*的緩沖液體系，在保證凝膠*融化的同時(shí)，防止了DNA片段的損壞和降解。純化后的DNA保持完整的生物活性，適用于多種用途:如連接、體外轉(zhuǎn)錄、PCR、測序、微注射等分子生物學(xué)研究。應(yīng)用: 酶切,連接,PCR等用途樣品: 從瓊脂糖凝膠中回收DNA片段

時(shí)間: 15分鐘

結(jié)合能力:25μg

洗脫體積:30-50μ

價(jià)格

50包裝270元

200包裝980元

約5元/反應(yīng)

50包裝350元

250包裝1570元

約7元/反應(yīng)

50包裝160元

100包裝240元

200包裝380元

500包裝750元

約3元/反應(yīng)

50包裝299

200包裝1100

約6元/反應(yīng)

(Q-spin)

大片段級：指的是片段大小超過10kb的DNA片斷，由于越長的DNA分子和純化膜的結(jié)合力越強(qiáng)，洗脫力越差，在離心過柱時(shí)可能被“扯斷”，因此常規(guī)的離心過柱的方法并不適合對付這些大家伙。在凝膠電泳的大片斷回收，特別是幾十kb的大片斷，經(jīng)典方法是生物通前文提到的電洗脫。此外，低熔點(diǎn)瓊脂糖和瓊脂糖酶消化也是常常有人選用的方法，新興的方法是用玻璃奶或者純化填料，生物通在此一并介紹。其實(shí)無論用什么方法，在回收大片斷時(shí)一定要牢記你對付的是大片斷，操作時(shí)一定要小心注意，粗暴的操作，zui后結(jié)果也是自己來承受的。這些方法中，速度zui快的就是玻璃奶或者純化填料珠的試劑盒了。畢竟，誰愿意為一個(gè)小小的膠回收浪費(fèi)2個(gè)多小時(shí)呢?有那功夫干點(diǎn)別的不好?我zui早用的其實(shí)是當(dāng)時(shí)的Pharmacia(后來改為Amersham，現(xiàn)在是GE Healthcare Life Sciences)的一個(gè)玻璃奶(Glassmilk)試劑盒?，F(xiàn)在記得Glassmilk的人應(yīng)該不多了，在當(dāng)時(shí)卻是我們眼中的神奇寶貝——半個(gè)多小時(shí)就可以完成本來要搞2個(gè)多小時(shí)的活：溶膠液溶膠后，加入10ul混勻的玻璃奶溶液，混勻靜置吸附后，離心去上清，再清洗1—2次，干燥，zui后用洗脫液洗脫，離心取上清即可。

1.QIAEX II

產(chǎn)地：Qiagen

回收范圍：40bp-50kb

指數(shù)：

價(jià)格指數(shù)：(150次反應(yīng)2,106，500包裝4,860，約14元/反應(yīng)，半價(jià)活動(dòng)開始以來，這個(gè)試劑盒的

性價(jià)比就很高啦)

特點(diǎn)：

. 通用性高：一般或者低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠，TAE或TBE，以及聚丙烯酰胺凝膠

. 無NaI干擾后續(xù)實(shí)驗(yàn)

. 大片段DNA保存較好，不會(huì)被剪切

使用心得：

這個(gè)試劑盒不同于Qiagen其它的膠回收試劑盒，利用的是配合高離液鹽(chaotropic salt)的silica-gelparticles，因此QiaEX可以從鹽，瓊脂糖凝膠，聚丙烯酰胺凝膠，染料，蛋白以及核苷酸中無需抽提或者酒精沉淀即可獲得純化DNA片段。這個(gè)試劑盒使用方法和玻璃奶的試劑盒基本一樣，區(qū)別在于玻璃奶是粉碎的玻璃，因此可能存在大小不一、邊緣尖銳等情況，在離心力下，大小不同的碎片的沉降系數(shù)不同而導(dǎo)致在沉淀中分布位置不同，當(dāng)長片斷一頭粘附在大片斷一頭吸附在小片斷上，離心產(chǎn)生的剪切力就會(huì)導(dǎo)致長片斷的斷裂。而QiaEX的純化填料是人工特制的大小均一的球形小珠(Beads)，能更好的吸附DNA，也不易產(chǎn)生上述的剪切力問題，使得回收的大片斷DNA更為完整。

無論是玻璃奶還是純化填料，比起過柱的方法，優(yōu)點(diǎn)在于適用于較大范圍的DNA回收，從小片斷到*片斷都可以，適用范圍廣;而且每次反應(yīng)可以根據(jù)估算的待回收DNA的量來放大或者縮小純化試劑的量，比較靈活。比如QIAEX說是150反應(yīng)(每次5ug)，實(shí)際上往往可以用200多次或者更多。但是這個(gè)方法的問題有2個(gè)，一個(gè)是比較麻煩，需要一定操作經(jīng)驗(yàn)——無論是清洗或者是zui后的洗脫，離心后要盡量多取上清而不干擾沉淀，多少有點(diǎn)點(diǎn)難度，特別是zui后取洗脫的DNA，要舍得放棄zui后那點(diǎn)上清，免得回收產(chǎn)物中混入了純化介質(zhì)，在后面的實(shí)驗(yàn)中得不償失。所以，你可以從此想象，由于每次離心沉淀后沉淀是浸在上清溶液中的，去除始終不*，這就注定了這個(gè)方法純化的產(chǎn)物純度不如離心高，回收率也不如那么高。你看，QIAEX說這個(gè)回收產(chǎn)物可用于酶切、連接、標(biāo)記和PCR，但是就沒有提到顯微注射芯片分析等更高要求的實(shí)驗(yàn)。另一個(gè)問題是干燥的程度如何把握需要一定經(jīng)驗(yàn)——干過頭了洗脫困難，沒干透就會(huì)將酒精帶入后繼實(shí)驗(yàn)(有人向生物通投訴過純化產(chǎn)物測OD得到非常奇怪的讀數(shù)，過去一看操作，果然是沒干透就洗脫的結(jié)果)——要干到沙面雪白而靠管壁的zui邊緣還有丁點(diǎn)透明就可以了。當(dāng)然，這個(gè)現(xiàn)象描述起來不著邊際，做過的人就心中了了。洗脫體積通常是20ul。操作要領(lǐng)除了前面提到的問題，就是離心充分，離心后取管子動(dòng)作輕快，事前調(diào)好加樣槍，取上清要輕，靠壁、放槍緩，動(dòng)作利索，不要千萬不要來回抽。舍得放棄。

QiaEX相關(guān)參數(shù)：

DNA size

Recovery*

44 bp

75%

75 bp

75%

500 bp

95%

7.5 kb

85%

23.5 kb

75%

48.5 kb

60%

Binding capacity:

5 μg DNA per 10 μl QIAEX II suspension

Recovery:

60–95% of DNA fragments (40 bp – 50 kb)

Elution volume:

Elution volume: 20 μl

類似方法的產(chǎn)品還包括Roche的Agarose Gel DNA Extraction Kit

2 Agarose Gel DNA Extraction Kit

產(chǎn)地：Roche-Applied Science

回收范圍：0.4kb—100kb(單核苷酸>20bp)

指數(shù)：

價(jià)格指數(shù)：(100次/1356，每次反應(yīng)13元左右)

特點(diǎn)：

. 標(biāo)準(zhǔn)的或低熔點(diǎn)瓊脂糖回收都可

. 可以用于克隆連接或者高特異性標(biāo)記(基本標(biāo)記或缺口平移primed labelling or nick translation)

. 0.4kb—9.5kb范圍內(nèi)回收率為80%

. 通用型試劑盒：大至100kbDNA片段到小到寡核苷酸都可以

. 操作簡單

. 均勻統(tǒng)一的純化介質(zhì)珠，減少剪切力，無雜質(zhì)(比如酶抑制劑)，不會(huì)影響后續(xù)反應(yīng)

使用心得：

Roche的膠回收試劑盒原理也是一樣的，可以完成幾乎實(shí)驗(yàn)室有關(guān)DNA膠回收的所有需要，從基因組大片段DNA到單核苷酸，并且在回收率上也有出彩的表現(xiàn)：0.4-9.5kb，大約80%;10-100kb，大約60%;單核苷酸(>20堿基)，大約65%.其實(shí)，生物通前面提到的純化介質(zhì)的方法在使用中有一些操作的問題，其實(shí)改良起來也并不很困難。只要多提供一個(gè)單純過濾離心柱，原來的問題看來應(yīng)該不難解決——直接將混合有純化介質(zhì)的溶膠液加入柱子中過濾離心，吸附了DNA的純化介質(zhì)在膜上，上清*離心到管中，不就不用擔(dān)心會(huì)懸浮沉淀、干沙等等問題了嗎?其實(shí)Promega就有這樣的解決方法，不過由于那試劑盒主要目的是純化PCR產(chǎn)物或者酶切反應(yīng)中的DNA，本身不帶溶膠液，所以我們在這里就不具體介紹了。這種方法通常需時(shí)半小時(shí)左右，算是比較快速省事的。畢竟大片斷的操作要格外小心。除了這種方法，

再重復(fù)介紹一下其他的一些方法。

1. 低熔點(diǎn)瓊脂糖：如果你手頭有Cambrex(原來的FMC，瓊脂糖行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的制定者)的SeaPlaque GTG瓊脂糖，那真是太幸福了。SeaPlaque是世界上*個(gè)低熔點(diǎn)瓊脂糖系列，Cambrex的GTG(遺傳技術(shù)級別)級瓊脂糖特別去除了抑制酶反應(yīng)的各種雜質(zhì)，可以在瓊脂糖凝膠中進(jìn)行各種酶切、連接、PCR、轉(zhuǎn)化等等實(shí)驗(yàn)。所以，SeaPlaque GTG凝膠電泳后切下的條帶就可以在65度融化(20-30度凝固)，直接進(jìn)行后繼的酶切連接PCR等等的反應(yīng)了，當(dāng)然，前提是你的電泳槽和Buffer要足夠干凈，是的。這個(gè)反應(yīng)條件實(shí)在是足夠溫和，當(dāng)然不便宜，25克瓊脂糖要1788大元!特別適合分辨200bp—25kb的片斷。其實(shí)，也就是大小通用的方法。如果只是普通的低熔點(diǎn)瓊脂糖也不要緊，切下來的膠塊加入緩沖液65度融化后冷卻到室溫，可以直接用等體積酚抽，也可以用瓊脂糖酶來消化。酚抽時(shí)注意不要?jiǎng)×艺袷幰悦鈸p傷大片斷DNA，兩相間的白色物質(zhì)是瓊脂糖，取上清酚氯仿抽提后乙醇沉淀。瓊脂糖酶可以消化融化的瓊脂糖為低聚糖，隨后用酚氯仿抽提后用乙醇沉淀。New England Biolabs的這種酶50單位價(jià)格300多，每200mg 1%凝膠用一個(gè)單位酶，

42度條件下反應(yīng)。Takara的這種酶100單位260多，同樣體積的凝膠要用2個(gè)單位，可以在60度反應(yīng)，所以也可以用常規(guī)瓊脂糖。只是常規(guī)瓊脂糖在65度挺難融，很費(fèi)時(shí)間。

2. 電洗脫的原理是將含DNA片斷的凝膠放在一個(gè)用半透膜隔離的空間中，通過電泳的電流使得DNA離開凝膠進(jìn)入液相，回收液相后純化沉淀其中的DNA分子。電洗脫主要的麻煩是在透析帶都比較大、兩頭要綁，沒有剛性的袋子使用不方便，中間溶液體積大，膜面積大容易吸附產(chǎn)物。生物通在03年就有文章介紹以色列一家公司出品的GeBA產(chǎn)品，是在離心指管兩邊開窗貼上透析膜，這種管子可用于透析或者電洗脫，由于管子有剛性，內(nèi)容體積固定，膜面積也很小，同時(shí)還提供電洗脫時(shí)放在電泳槽中的架子，操作起來十分方便，很大程度上決了這個(gè)困擾。電洗脫條件溫和，對瓊脂糖沒有特殊要求，同時(shí)還可以用于丙烯酰胺凝膠中的片斷回收或者是蛋白質(zhì)的回收。GeBA的產(chǎn)品基因有限公司有售，此外Merck旗下的Novagen也引進(jìn)了類似的產(chǎn)品，價(jià)格相當(dāng)。詳細(xì)信息參考：從PAGE膠/瓊脂糖凝膠中回收蛋白質(zhì)/RNA/DNA的新工具。

3. 挖槽法。限于個(gè)人習(xí)慣的一些不入流的小技巧，有時(shí)應(yīng)急(比如定的產(chǎn)品老不到貨時(shí))也可以對付一下。無非就是在條帶前面挖坑，加入緩沖液，繼續(xù)電泳半分鐘，手提紫外觀察，等條帶全“下海”就把坑里的溶液都吸上來。大片斷會(huì)遇到的問題通常是出膠慢，上對岸倒快，所以應(yīng)對就要用2手，一個(gè)是在坑里緩沖液中加點(diǎn)什么讓泳動(dòng)速度降下來(低熔點(diǎn)瓊脂糖就是其中一個(gè)方法)，要不就在對岸堵上孔徑特小的膜，等這邊條帶全部下后反向電泳一下，讓被膜阻擋的DNA回頭，離開那膜。然后取溶液純化DNA。這些方法通常在條帶濃，回收率要求不高的時(shí)候可以應(yīng)急，挺磨耐性的，平常還是用Kit的算了。這里提到的老方法，都要特別注意，切膠的刀要干凈鋒利，切口平滑，切得不整齊有時(shí)DNA出膠很慢，不知道為什么。我們這里寫寫，算是憶苦思甜好了。

講完大片斷，剩下就是小片斷的回收了。小于100bp的片斷通常在電泳時(shí)就比較難觀察分辨，需要用分辨率很高的瓊脂糖或者丙烯酰胺凝膠。比如Cambrex的NuSieve 3:1或者GTG，或者是大名鼎鼎的MetaPhor瓊脂糖。所以實(shí)際上對于小片斷，可以分為兩種情況：一個(gè)是真的要回收電泳中特別小的片斷，這種情況我們前面有提到，比如Qiagen MinElute系列可以回收70bp以上的片斷;而QIAEX純化介質(zhì)可以回收40bp以上的小片斷，可以根據(jù)情況選擇，生物通在這里不再羅嗦了。另外一種情況是要去除一些小片斷或者是核苷酸、標(biāo)記物、或者是一些酶切碎片，或者去掉接頭(Linker/Adeptor)或者什么的。其實(shí)這時(shí)已經(jīng)不需要用電泳來分別，也就算不上膠回收的范圍，不過既然提到了就順手寫寫。PCR產(chǎn)物回收試劑盒實(shí)際上也是一種除去小片斷的試劑盒，通常回收范圍是100bp到10KB之間，也就是說將小于100bp(或者70bp)的引物或者引物二聚體連同其他雜質(zhì)一同去除，操作簡單，只需要將PCR產(chǎn)物加入過濾純化柱中離心，清洗一次，洗脫就可以了，5分鐘搞定，回收率高達(dá)95%。PCR后需要酶切時(shí)，以前常常為省略跑膠純化的步驟，要在PCR產(chǎn)物中直接酶切，往往導(dǎo)致一些酶切問題，如今用這種PCR產(chǎn)物純化試劑盒就不用電泳，5分鐘OK了。用不著冒險(xiǎn)直接酶切——萬一酶切有問題多麻煩呀。通常同一個(gè)品牌的PCR產(chǎn)純化試劑盒和膠回收試劑盒的柱子是同樣的柱子，區(qū)別是膠回收試劑盒多一個(gè)溶膠液。所以，你可以用膠回收試劑盒做PCR產(chǎn)物純化，溶膠液照加可也，調(diào)pH和鹽濃度而已。如果需要純化寡核苷酸或者引物，Qiagen的QIAquick Nucleotide Removal Kit是一個(gè)好選擇?？梢杂糜诩兓?7-40mer的寡核苷酸小分子，以及40bp-10kb的DNA。用于純化標(biāo)記反應(yīng)是不錯(cuò)的選擇，方法和PCR產(chǎn)物回收試劑盒是一樣的，很方便。除了這種膜吸附的柱子，還有一種凝膠過濾原理的柱子也可以用于分段收集不同大小的產(chǎn)物，那個(gè)在建庫等實(shí)驗(yàn)中用的比較多，也有用于純化標(biāo)記反應(yīng)中的未標(biāo)記分子或者核苷酸的。很小的DNA片斷常常會(huì)用PAGE膠電泳。PAGE膠好像還沒有很好的溶解方法，除了我們前面提到的電洗脫，Qiagen還提供一些私人方法，在應(yīng)急的時(shí)候可以嘗試。將切割下來的PAGE條帶沖洗后加入指管中，加入2倍體積的分散緩沖液(0.5M醋酸胺、10mM的醋酸鎂，1mM EDTA， 0.1%SDS，pH8.0)50度保溫30分鐘，離心取上清，避免混入碎膠，加入3倍體積的溶膠液，后面步驟一樣。這樣也可以回收PAGE膠里的片斷。