A液：1M，MnCl2：
B液：1M，HEPES，pH=6.2-6.8，用無(wú)菌水配，配后不需滅菌;
C液 稱(chēng)取CaCl2 0.10g，KCl 1.18g，全部轉(zhuǎn)入細(xì)口試劑瓶，然后加入46ml三蒸水，輕輕振蕩使所有組分充分溶解。將瓶塞蓋上并用牛皮紙、棉線包扎，然后放入滅菌鍋121℃高壓滅菌備用。
取1管B液(0.6ml)，全部加入C液(46ml)中，混勻后，再用1ml移液器加入3.3ml A液，混勻冰浴即可使用。
劃線得到單菌落,37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)約17小時(shí)， 挑取2-4個(gè)形態(tài)飽滿的單菌落接種于裝有100ml SOB 培養(yǎng)基的三角瓶,37℃劇烈振蕩(300 rpms)培養(yǎng)3-4小時(shí), 將培養(yǎng)溫度調(diào)至18℃劇烈振蕩(3280 rpms)培養(yǎng)，其余與普通感受態(tài)差不多，每管加入4ml TB緩沖液，輕輕振蕩，使菌體重新懸浮，加入280ml DMSO(可用國(guó)產(chǎn)分析純)，混勻后分裝入1.5ml EP管，冰上靜置15分鐘。用紗布將所有裝有感受態(tài)的EP管包好，用棉線系好后放入液氮中速凍，在液氮中靜置12小時(shí)以上。取出感受態(tài)放入-70℃超低溫冰箱備用。
效率非常高，一般可到10*8，好時(shí)可到10*9，特別適宜于大片段與文庫(kù)構(gòu)建及珍貴材料的連接轉(zhuǎn)化。
潔凈是zui重要的。無(wú)菌都無(wú)所謂，在操作臺(tái)上可正常操作。離心力要注意不要超過(guò)2500g,建議1500-2000g 5min。涂板要注意，不要覺(jué)得不勻而多次反復(fù)，輕輕在平板上帶一下感覺(jué)板上大部分地方走過(guò)即可，特別在冰箱中保存過(guò)或在溫箱中溫浴2小時(shí)以上的板。涂完后建議空氣晾干(20-30分鐘)這樣會(huì)減少衛(wèi)星菌落出現(xiàn)。
預(yù)冷是必要的。整個(gè)過(guò)程的低溫也并非特別重要，只要注意就行了，我在去殘液時(shí)經(jīng)常在室溫倒置1min，對(duì)感受態(tài)效率提高有幫助，*次多加一點(diǎn)緩沖液，我經(jīng)常加至20ml，效果不錯(cuò)。
關(guān)于大腸桿菌的感受態(tài)制備及轉(zhuǎn)化的方法很多，zui復(fù)雜的莫過(guò)于電轉(zhuǎn)化，而zui簡(jiǎn)單的則是將LB平板上的菌落直接挑入裝有緩沖液的EP管冰箱即開(kāi)始轉(zhuǎn)化。對(duì)于做克隆工作的人而言，高而穩(wěn)定的感受態(tài)可減輕不少麻煩。
現(xiàn)在大腸桿菌轉(zhuǎn)化效率zui高的要數(shù)電轉(zhuǎn)化，可達(dá)到1010，但是操作起來(lái)比較麻煩。要想又簡(jiǎn)單，又能有較高的轉(zhuǎn)化效率，的莫過(guò)于1990年《GENE》上刊登的由Inoue H.等提出的感受態(tài)的制備與轉(zhuǎn)化方法。
根據(jù)實(shí)驗(yàn)室的實(shí)際情況，我們將其稍作修改，做成了GLP文件，但其中仍有許多可改進(jìn)或需要注意的地方，其中有一些對(duì)普通感受態(tài)效率的提高也有一定的幫助。
1、所用器具的潔凈程度。這一點(diǎn)非常重要，是所有與感受態(tài)有關(guān)的方法與文章上必講的，毋庸置疑。
2、培養(yǎng)基的裝量：培養(yǎng)基的裝量是很重要的，這關(guān)系到菌體生長(zhǎng)過(guò)程中的能量代謝問(wèn)題，是有氧還是無(wú)氧生長(zhǎng)。厭氧生長(zhǎng)出來(lái)的菌體是做不出效率高的感受態(tài)的。建議裝量不要高于此值為：培養(yǎng)基體積/三角瓶容量=100ml/500ml，50ml/250ml。
3、培養(yǎng)基的pH值。這是講的pH值并非單指配置或滅菌后的pH值，而且還包括整個(gè)搖瓶結(jié)束后的pH值。一般來(lái)說(shuō)，接種前的pH值在6.8-7.2，等菌搖好后，可以測(cè)一下pH值，不要低于6.0，在6.5以上。這表示菌體的代謝為有氧代謝，生長(zhǎng)狀態(tài)良好，按要求做，肯定效率不低。
4、培養(yǎng)后的OD值。其實(shí)這并一個(gè)非常重要的參數(shù)，只是當(dāng)OD值大到一定的程度后，菌體要保持對(duì)數(shù)生長(zhǎng)已經(jīng)不太可能，因此很多指導(dǎo)方法上強(qiáng)調(diào)OD不得大于0.6，0.8等等。同時(shí)，OD值大時(shí)菌體總量大，因而感受態(tài)數(shù)量要大一點(diǎn)，因而需要在OD值的兩方面影響中找一個(gè)平衡點(diǎn)。
5、培養(yǎng)基中的各種離子。經(jīng)驗(yàn)證明，當(dāng)培養(yǎng)基中存在一定量的Mg2 離子時(shí)，該方法制得的感受態(tài)要相對(duì)較高。在制備普通感受時(shí)，使用20mM MgCl2做為培養(yǎng)基的添加物，在感受態(tài)收獲之前20-30分鐘加入，會(huì)收到很好的效果。
6、培養(yǎng)溫度。文獻(xiàn)及經(jīng)驗(yàn)告訴我們，較低的溫度培養(yǎng)有利于感受態(tài)的形成，這樣可以獲得較高的感受態(tài)，但太低又不實(shí)用，因而產(chǎn)生了Inoue的感受態(tài)制備方法，它實(shí)際是利用了所有有利于感受態(tài)的文獻(xiàn)而得出的一個(gè)非常理想方法。
7、此外文獻(xiàn)報(bào)道，在保存感受態(tài)時(shí)，DMSO要比甘油的效果要好，它會(huì)使感受態(tài)的效率增加。
8、液氮速凍也會(huì)使感受態(tài)的效率提高，因此用液氮速凍感受態(tài)，然后保存于超低溫冰箱內(nèi)。至于在液氮中保存12小時(shí)以后再轉(zhuǎn)入超低溫冰箱，這點(diǎn)未做實(shí)驗(yàn)，只是一種感覺(jué)，*次這樣做了，沒(méi)問(wèn)題，以后就照此辦理而已。
方法二
1.液氮或低溫冰箱中取出的大腸桿菌*E.COLI DH5, JM109,HB101等,在LB平板上劃線,37度過(guò)夜至長(zhǎng)出單菌落.
2.挑直徑1-3毫米的單菌落*可多個(gè), 接種到250毫升/3升錐形瓶 或80毫升/1升錐形瓶的SOB培養(yǎng)基. 培養(yǎng)基量不可再多,會(huì)影響效率.
3.在18度 150-250RPM 培養(yǎng)19-50小時(shí)*沒(méi)有冷卻搖床的可在室溫, 但不可高于37度.
4.OD600約0.4-0.8時(shí)停止培養(yǎng), 放在冰水中冷卻10分鐘
5. 4度, 300RPM離心15分鐘, 回收菌體
6.去掉上清后, 用1/3體積的冰冷TB溶液懸浮, 在冷10分鐘
7.再次離心回收菌體
8.用1/12.5體積的TB懸浮, 添加zui終濃度為7%的DMSO, 再冷卻10分鐘
9.0.1-1毫升分裝, 直接在液氮中凍上.
10.在液氮或-80度保存.
【zihudie】
(1)將置于液氮保存的大腸桿菌劃線在LB平板上，37℃培養(yǎng)活化。
(2)挑取經(jīng)活化的大腸桿菌單菌落于SOC液體培養(yǎng)基，18℃，200-250rpm培養(yǎng)。
(3)當(dāng)OD600=0.5-0.8時(shí)，用預(yù)冷的40mL離心管于4℃，8000rpm離心10min，收集菌體。
(4)用預(yù)冷的TB Buffer重懸菌體，4℃，8000rpm離心10min，收集菌體。
(5)重復(fù)第4步操作。
(6)用8mL預(yù)冷的TB Buffer重懸菌體，緩慢加入DMSO至終濃度7% 。
(7)冰浴10min后，分裝保存于液氮中。
本法效率*,建議大家采納
【yog】
1. 單菌落-------2ml LB 37度 120RPM過(guò)夜------1%轉(zhuǎn)接-------37度 200RPM2小時(shí)(OD到0.4~0.5)
2. 2ml, 冰浴15min, 4度, 6000RPM 5min, 棄上清, 懸浮于1ml0.1MCaCl2中, 冰浴20min
3. 4度, 6000RPM 10min, 重懸浮于200ul 0.1MCaCl2中, 冰浴30min
建議用TSS法，簡(jiǎn)單方便，比氯化鈣法的轉(zhuǎn)化效率高.別的菌可能不一定適用。
以下為轉(zhuǎn)貼，具體方法請(qǐng)查閱文獻(xiàn)。
E.coli感受態(tài)細(xì)胞制備方法:
單菌落平板至2ml LB, 37℃ 250 r/m, 1ml 轉(zhuǎn)至50 ml LB, 37oC 250 r/m至 A600
=0.2-0.4
離心后用10毫升TSS重懸后,分裝 -70oC保存。盡量冰上操作.
轉(zhuǎn)化: 加質(zhì)粒(<5 ul/100ul cell) 后冰上30分鐘，42℃ 90秒，冰上2分鐘，加LB至1ml
, 37℃ 1小時(shí)后鋪抗生素平板。
TSS:
7.0ml pH6.1 LB
2.0ml 50% PEG6000
0.5ML dmso
0.2ML Mg2 (0.1ml 1mol/l MgCl2 and 0.1ml 1mol/l MgSO4)
0.3ml ddH2O
