一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/span>
1．了解微核測試的原理和毒理遺傳學(xué)在實(shí)際生活與工作中的應(yīng)用范圍及意義
2．學(xué)習(xí)蠶豆根尖的微核測試技術(shù)
二、實(shí)驗(yàn)原理
微核簡稱(MCN)，是真核生物細(xì)胞中的一種異常結(jié)構(gòu)，往往是細(xì)胞經(jīng)輻射或化學(xué)藥物的作用而產(chǎn)生。在細(xì)胞間期微核呈圓形或橢圓形，游離于主核之外、大小應(yīng)在主核1／3以下。微核的折光率及細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)性質(zhì)和主核一樣。一般認(rèn)為微核是由有絲分裂后期喪失著絲粒的斷片產(chǎn)生的，但有些實(shí)驗(yàn)也證明整條的染色體或多條染色體也能形成微核。這些斷片或染色體在細(xì)胞分裂末期被兩個子細(xì)胞核所排斥便形成了第三個核塊。已經(jīng)證實(shí)微核率的大小是和用藥的劑量或輻射累積效應(yīng)呈正相關(guān)，這一點(diǎn)和染色體畸變的情況一樣。所以可用簡易的間期微核計(jì)數(shù)來代替繁雜的中期畸變?nèi)旧w計(jì)數(shù)。由于大量新的化合物的合成，原子能應(yīng)用，各種各樣工業(yè)廢物的排出，使人們很需要有一套高度靈敏，技術(shù)簡單的測試系統(tǒng)來監(jiān)視環(huán)境的變化。只有真核的測試系統(tǒng)更能直接推測誘變物質(zhì)對人類或其它高等生物的遺傳危害，在這方面，微核測試是一種比較理想的方法。且有研究顯示以植物進(jìn)行微核測試與以動物進(jìn)行的一致率可達(dá)99%以上。目前微核測試已經(jīng)廣泛應(yīng)用于輻射損傷、輻射防護(hù)、化學(xué)誘變劑、新藥試驗(yàn)、染色體遺傳疾病及癌癥前期診斷等各方面。
利用蠶豆根尖作為實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行微核測試，可準(zhǔn)確的顯示各種處理誘發(fā)畸變的效果，并可用于污染程度的監(jiān)測。
三、實(shí)驗(yàn)材料
松滋青皮豆（蠶豆）種子
四、實(shí)驗(yàn)器具和藥品
實(shí)驗(yàn)器具：顯微鏡、載玻片、蓋玻片、培養(yǎng)皿、濾紙
實(shí)驗(yàn)藥品：氯化鈷
五、實(shí)驗(yàn)過程
1．實(shí)驗(yàn)材料的培育
蠶豆根尖細(xì)胞的染色體大，DNA含量高．因而對誘變因子反應(yīng)敏感。松滋青皮豆是從不同蠶豆品種中篩選出來的一種較為敏感的品種。本品種引入后在栽培繁殖時要注意不要同其它蠶豆品種種在一起，不噴灑、以保持該品種較低的本底微核值。也可用其它蠶豆品種，但是必須設(shè)置對照組。種子成熟后，曬干貯藏于干燥器內(nèi)或4℃冰箱內(nèi)備用。
2．浸種催芽：將實(shí)驗(yàn)用蠶豆種子按需要量放入盛有蒸餾水的燒杯中，在25℃下浸泡24小時，此間至少換水兩次．所換水應(yīng)25℃預(yù)溫。種子吸脹后；用紗布松散包裹置白磁盤中，保持濕度，在25℃溫箱中催芽12－24小時，待初生根長出2—3mm時，再取發(fā)芽良好的種子，放入鋪滿濾紙的磁盤中，25℃繼續(xù)催芽，經(jīng)約36～48小時．大部分初生根長至1～2cm左右，根毛發(fā)育良好，這時即可用來進(jìn)行檢測了。
3． 處理
用被檢測液處理根尖，每一處理選取6－8粒初生根尖生長良好、根長一致的種子，放入盛有被檢測液的培養(yǎng)皿中，被檢測液浸泡根尖。同時，取另一培養(yǎng)皿以蒸餾水處理根尖，作為對照。
處理時間約為6小時（此時間可根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求和被檢測液的濃度等情況而定）。
4．根尖細(xì)胞恢復(fù)培養(yǎng)
將處理后的種子用蒸餾水浸洗三次，每次2－3min。將洗凈的種子再放入鋪好濾紙或脫脂棉的白磁盤內(nèi)25℃溫箱中恢復(fù)培養(yǎng)22－24小時。
5．固定根尖細(xì)胞
將恢復(fù)后的種子從根尖頂端切下1cm長的幼根放入廣口瓶中，以卡納氏固定液進(jìn)行固定2-24小時后，保存于70%乙醇溶液中。
6．鏡檢及微核識別標(biāo)準(zhǔn)
常規(guī)制片后，將玻片標(biāo)本放在顯微鏡的低倍鏡下觀察，找到分生組織區(qū)細(xì)胞分散良好、核膨大、分裂相多的部分轉(zhuǎn)到高倍鏡下進(jìn)行觀察。
微核識別標(biāo)準(zhǔn)：
（1）在主核大小的1/3以下，并與主核分離的小核。
（2）小核著色與主核相當(dāng)或稍淺。
（3）小核形態(tài)為圓形、橢圓形或不規(guī)則型。
每一處理觀察3個根尖，每個根尖計(jì)數(shù)1000個細(xì)胞中的微核數(shù)并進(jìn)行記錄。