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釀酒酵母感受態(tài)細(xì)胞的制備、轉(zhuǎn)化
點(diǎn)擊次數(shù)：2583 發(fā)布時(shí)間：2012-10-29
釀酒酵母感受態(tài)細(xì)胞的制備、轉(zhuǎn)化
釀酒酵母感受態(tài)細(xì)胞的制備
（1）從YPD平板上挑取一個(gè)新鮮的釀酒酵母EBY100單克隆至10 mlYPD液體培養(yǎng)基，30℃，250 rpm培養(yǎng)過(guò)夜；
（2）測(cè)定過(guò)夜培養(yǎng)物的OD600值為3.0～5.0之間；
（3）將10 ml YPD過(guò)夜培養(yǎng)物稀釋至OD600值為0.2～0.4；
（4）在28～30℃搖床中繼續(xù)培養(yǎng)3～6hr，使其OD600值達(dá)到0.6～1.0；
（5）于室溫1500g離心5 min收集酵母細(xì)胞，棄上清；
用10ml洗液洗酵母細(xì)胞，隨后于室溫1500g離心5 min離心收集細(xì)胞，棄上清；
（7）用1 ml TE/LiAc重懸酵母細(xì)胞，以每管50μl分裝。
釀酒酵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化
（1）取50μl感受態(tài)細(xì)胞，再加入待轉(zhuǎn)質(zhì)粒各2μl，混勻；
（2）加入500μl 轉(zhuǎn)化用溶液（PEG/LiAc,二甲亞砜），彈擊管壁混勻；
（3）30℃水浴1hr,隔15min彈擊管壁混勻；
（4）加入1毫升YPD培養(yǎng)液，30℃搖床培養(yǎng)1小時(shí)
（5）3500g離心5 min ，留沉淀，棄上清；
沉淀用150μl TE重懸，涂相應(yīng)的SD平板；將平板倒置于30℃培養(yǎng)。