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微生物菌種的退化與復(fù)壯
最近更新時間：2012-11-8
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詳細(xì)介紹：
微生物菌種的退化與復(fù)壯
菌種由于培養(yǎng)條件和傳代方法的不同極易產(chǎn)生基因變異，其中負(fù)變異即菌種退化將對后續(xù)試驗造成重大影響，本文將對退化菌株的復(fù)壯進行詳細(xì)介紹。
1. 菌種的退化與復(fù)壯
1.1. 菌種的退化現(xiàn)象
隨著菌種保藏時間的延長或菌種的多次轉(zhuǎn)接傳代，菌種本身所具有的優(yōu)良的遺傳性狀可能得到延續(xù)，也可能發(fā)生變異。變異有正變（自發(fā)突變）和負(fù)變兩種，其中負(fù)變即菌株生產(chǎn)性狀的劣化或有些遺傳標(biāo)記的丟失均稱為菌種的退化。但是在生產(chǎn)實踐中，必須將由于培養(yǎng)條件的改變導(dǎo)致菌種形態(tài)和生理上的變異與菌種退化區(qū)別開來。因為優(yōu)良菌株的生產(chǎn)性能是和發(fā)酵工藝條件緊密相關(guān)的。如果培養(yǎng)條件發(fā)生變化，如培養(yǎng)基中缺乏某些元素，會導(dǎo)致產(chǎn)孢子數(shù)量減少，也會引起孢子顏色的改變；溫度、pH值的變化也會使發(fā)酵產(chǎn)量發(fā)生波動等。所有這些，只要條件恢復(fù)正常，菌種原有性能就能恢復(fù)正常，因此這些原因引起的菌種變化不能稱為菌種退化。常見的菌種退化現(xiàn)象中，zui易覺察到的是菌落形態(tài)、細(xì)胞形態(tài)和生理等多方面的改變，如菌落顏色的改變，畸形細(xì)胞的出現(xiàn)等；菌株生長變得緩慢，產(chǎn)孢子越來越少直至產(chǎn)孢子能力喪失，例如放線菌、霉菌在斜面上多次傳代后產(chǎn)生“光禿”現(xiàn)象等，從而造成生產(chǎn)上用孢子接種的困難；還有菌種的代謝活動，代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)能力或其對寄主的寄生能力明顯下降，例如黑曲霉糖化能力的下降，抗菌素發(fā)酵單位的減少，枯草桿菌產(chǎn)*能力的衰退等。所有這些都對發(fā)酵生產(chǎn)均不利。因此，為了使菌種的優(yōu)良性狀持久延續(xù)下去，必須做好菌種的復(fù)壯工作。即在各菌種的優(yōu)良性狀沒有退化之前，定期進行純種分離和性能測定。
1.2. 菌種退化的原因
菌種退化的主要原因是有關(guān)基因的負(fù)突變。當(dāng)控制產(chǎn)量的基因發(fā)生負(fù)突變，就會引起產(chǎn)量下降；當(dāng)控制孢子生成的基因發(fā)生負(fù)突變，則使菌種產(chǎn)孢子性能下降。一般而言，菌種的退化是一個從量變到質(zhì)變的逐步演變過程。開始時，在群體中只有個別細(xì)胞發(fā)生負(fù)突變，這時如不及時發(fā)現(xiàn)并采用有效措施而一味移種傳代，就會造成群體中負(fù)突變個體的比例逐漸增高，zui后占優(yōu)勢，從而使整個群體表現(xiàn)出嚴(yán)重的退化現(xiàn)象。因此，突變在數(shù)量上的表現(xiàn)依賴于傳代，即菌株處于一定條件下，群體多次繁殖，可使退化細(xì)胞在數(shù)量上逐漸占優(yōu)勢，于是退化性狀的表現(xiàn)就更加明顯，逐漸成為一株退化了的菌體。同時，對某一菌株的特定基因來講，突變頻率比較低，因此群體中個體發(fā)生生產(chǎn)性能的突變不是很容易的，但就一個經(jīng)常處于旺盛生長狀態(tài)的細(xì)胞而言，發(fā)生突變的機率比處于休眠狀態(tài)的細(xì)胞大得多，因此，細(xì)胞的代謝水平與基因突變關(guān)系密切，應(yīng)設(shè)法控制細(xì)胞保藏的環(huán)境，使細(xì)胞處于休眠狀態(tài)，從而減少菌種的退化。
1.3. 防止退化的措施
合理的育種 選育菌種時所處理的細(xì)胞應(yīng)使用單核的，避免使用多核細(xì)胞；
合理選擇誘變劑的種類和劑量或增加突變位點，以減少分離回復(fù)；在誘變處理后進行充分的后培養(yǎng)及分離純化，以保證保藏菌種純碎。這些可有效的防止菌種的退化。
選用合適的培養(yǎng)基 有人發(fā)現(xiàn)用老苜蓿根汁培養(yǎng)基培養(yǎng)“5406”抗生菌—細(xì)黃鏈霉菌可以防止它的退化。在赤霉菌產(chǎn)生菌—藤倉赤霉的培養(yǎng)基中，加入糖蜜、天門冬素、*、5-核苷酸或*等物質(zhì)時，也有防止菌種退化的效果。也有選取營養(yǎng)相對貧乏的培養(yǎng)基做菌種保藏培養(yǎng)基，如培養(yǎng)基中適當(dāng)限制容易利用的糖源葡萄糖等的添加，因為變異多半是通過菌株的生長繁殖而產(chǎn)生的，當(dāng)培養(yǎng)基營養(yǎng)豐富時，菌株會處于旺盛的生長狀態(tài)，代謝水平較高，為變異提供了良好的條件，大大提高了菌株的退化幾率。
創(chuàng)造良好的培養(yǎng)條件 在生產(chǎn)實踐中，創(chuàng)造和發(fā)現(xiàn)一個適合原種生長的條件可以防止菌種退化，如低溫、干燥、缺氧等。在棲土曲霉3．942 的培養(yǎng)中，有人曾用改變培養(yǎng)溫度的措施（從20-30℃提高到33-34℃）來防止它產(chǎn)孢子能力的退化。
控制傳代次數(shù) 由于微生物存在著自發(fā)突變，而突變都是在繁殖過程中發(fā)生而表現(xiàn)出來的。所以應(yīng)盡量避免不必要的移種和傳代，把必要的傳代降低到zui低水平，以降低自發(fā)突發(fā)的機率。菌種傳代次數(shù)越多，產(chǎn)生突變的幾率就越高，因而菌種發(fā)生退化的機會就越多。這要求不論在實驗室還是在生產(chǎn)實踐上，必須嚴(yán)格控制菌種的移種傳代次數(shù)，并根據(jù)菌種保藏方法的不同，確立恰當(dāng)?shù)囊品N傳代的時間間隔。如同時采用斜面保藏和其它的保藏方式（真空凍干保藏、砂土管、液氮保藏等），以延長菌種保藏時間。
利用不同類型的細(xì)胞進行移種傳代 在有些微生物中，如放線菌和霉菌，由于其菌的細(xì)胞常含有幾個核或甚至是異核體，因此用菌絲接種就會出現(xiàn)不純和衰退，而孢子一般是單核的，用它接種時，就沒有這種現(xiàn)象發(fā)生。有人在實踐中發(fā)現(xiàn)構(gòu)巢曲霉如用分生孢子傳代就容易退化，而改用子囊孢子移種傳代則不易退化；還有人采用滅過菌的棉團輕巧地沾取“5406”孢子進行斜面移種，由于避免了菌絲的接入，因而達(dá)到了防止退化的效果。
采用有效的菌種保藏方法 用于工業(yè)生產(chǎn)的一些微生物菌種，其主要性狀都屬于數(shù)量性狀，而這類性狀恰是zui容易退化的。因此，有必要研究和制定出更有效的菌種保藏方法以防止菌種退化。
1.4. 退化菌種的復(fù)壯
退化菌種的復(fù)壯可通過純種分離和性能測定等方法來實現(xiàn)，其中一種是從退化菌種的群體中找出少數(shù)尚未退化的個體，以達(dá)到恢復(fù)菌種的原有典型性狀。另一種是在菌種的生產(chǎn)性能尚未退化前就經(jīng)常而有意識地進行純種分離和生產(chǎn)性能的測定工作，以達(dá)到菌種的生產(chǎn)性能逐步有所提高。所以這實際上是一種利用自發(fā)突變不斷從生產(chǎn)中進行選種的工作。具體的菌種的復(fù)壯措施如下：
純種分離 采用平板劃線分離法、稀釋平板法或涂布法均可。把仍保持原有典型優(yōu)良性狀的單細(xì)胞分離出來，經(jīng)擴大培養(yǎng)恢復(fù)原菌株的典型優(yōu)良性狀，若能進行性能測定則更好。還可用顯微鏡操縱器將生長良好的單細(xì)胞或單孢子分離出來，經(jīng)培養(yǎng)恢復(fù)原菌株性狀。
通過寄主進行復(fù)壯 寄生型微生物的退化菌株可接種到相應(yīng)寄主體內(nèi)以提高菌株的活力。
聯(lián)合復(fù)壯 對退化菌株還可用高劑量的紫外線輻射和低劑量的DTG聯(lián)合處理進行復(fù)壯。
1.1. 菌種的退化現(xiàn)象
隨著菌種保藏時間的延長或菌種的多次轉(zhuǎn)接傳代，菌種本身所具有的優(yōu)良的遺傳性狀可能得到延續(xù)，也可能發(fā)生變異。變異有正變（自發(fā)突變）和負(fù)變兩種，其中負(fù)變即菌株生產(chǎn)性狀的劣化或有些遺傳標(biāo)記的丟失均稱為菌種的退化。但是在生產(chǎn)實踐中，必須將由于培養(yǎng)條件的改變導(dǎo)致菌種形態(tài)和生理上的變異與菌種退化區(qū)別開來。因為優(yōu)良菌株的生產(chǎn)性能是和發(fā)酵工藝條件緊密相關(guān)的。如果培養(yǎng)條件發(fā)生變化，如培養(yǎng)基中缺乏某些元素，會導(dǎo)致產(chǎn)孢子數(shù)量減少，也會引起孢子顏色的改變；溫度、pH值的變化也會使發(fā)酵產(chǎn)量發(fā)生波動等。所有這些，只要條件恢復(fù)正常，菌種原有性能就能恢復(fù)正常，因此這些原因引起的菌種變化不能稱為菌種退化。常見的菌種退化現(xiàn)象中，zui易覺察到的是菌落形態(tài)、細(xì)胞形態(tài)和生理等多方面的改變，如菌落顏色的改變，畸形細(xì)胞的出現(xiàn)等；菌株生長變得緩慢，產(chǎn)孢子越來越少直至產(chǎn)孢子能力喪失，例如放線菌、霉菌在斜面上多次傳代后產(chǎn)生“光禿”現(xiàn)象等，從而造成生產(chǎn)上用孢子接種的困難；還有菌種的代謝活動，代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)能力或其對寄主的寄生能力明顯下降，例如黑曲霉糖化能力的下降，抗菌素發(fā)酵單位的減少，枯草桿菌產(chǎn)*能力的衰退等。所有這些都對發(fā)酵生產(chǎn)均不利。因此，為了使菌種的優(yōu)良性狀持久延續(xù)下去，必須做好菌種的復(fù)壯工作。即在各菌種的優(yōu)良性狀沒有退化之前，定期進行純種分離和性能測定。
1.2. 菌種退化的原因
菌種退化的主要原因是有關(guān)基因的負(fù)突變。當(dāng)控制產(chǎn)量的基因發(fā)生負(fù)突變，就會引起產(chǎn)量下降；當(dāng)控制孢子生成的基因發(fā)生負(fù)突變，則使菌種產(chǎn)孢子性能下降。一般而言，菌種的退化是一個從量變到質(zhì)變的逐步演變過程。開始時，在群體中只有個別細(xì)胞發(fā)生負(fù)突變，這時如不及時發(fā)現(xiàn)并采用有效措施而一味移種傳代，就會造成群體中負(fù)突變個體的比例逐漸增高，zui后占優(yōu)勢，從而使整個群體表現(xiàn)出嚴(yán)重的退化現(xiàn)象。因此，突變在數(shù)量上的表現(xiàn)依賴于傳代，即菌株處于一定條件下，群體多次繁殖，可使退化細(xì)胞在數(shù)量上逐漸占優(yōu)勢，于是退化性狀的表現(xiàn)就更加明顯，逐漸成為一株退化了的菌體。同時，對某一菌株的特定基因來講，突變頻率比較低，因此群體中個體發(fā)生生產(chǎn)性能的突變不是很容易的，但就一個經(jīng)常處于旺盛生長狀態(tài)的細(xì)胞而言，發(fā)生突變的機率比處于休眠狀態(tài)的細(xì)胞大得多，因此，細(xì)胞的代謝水平與基因突變關(guān)系密切，應(yīng)設(shè)法控制細(xì)胞保藏的環(huán)境，使細(xì)胞處于休眠狀態(tài)，從而減少菌種的退化。
1.3. 防止退化的措施
合理的育種 選育菌種時所處理的細(xì)胞應(yīng)使用單核的，避免使用多核細(xì)胞；
合理選擇誘變劑的種類和劑量或增加突變位點，以減少分離回復(fù)；在誘變處理后進行充分的后培養(yǎng)及分離純化，以保證保藏菌種純碎。這些可有效的防止菌種的退化。
選用合適的培養(yǎng)基 有人發(fā)現(xiàn)用老苜蓿根汁培養(yǎng)基培養(yǎng)“5406”抗生菌—細(xì)黃鏈霉菌可以防止它的退化。在赤霉菌產(chǎn)生菌—藤倉赤霉的培養(yǎng)基中，加入糖蜜、天門冬素、*、5-核苷酸或*等物質(zhì)時，也有防止菌種退化的效果。也有選取營養(yǎng)相對貧乏的培養(yǎng)基做菌種保藏培養(yǎng)基，如培養(yǎng)基中適當(dāng)限制容易利用的糖源葡萄糖等的添加，因為變異多半是通過菌株的生長繁殖而產(chǎn)生的，當(dāng)培養(yǎng)基營養(yǎng)豐富時，菌株會處于旺盛的生長狀態(tài)，代謝水平較高，為變異提供了良好的條件，大大提高了菌株的退化幾率。
創(chuàng)造良好的培養(yǎng)條件 在生產(chǎn)實踐中，創(chuàng)造和發(fā)現(xiàn)一個適合原種生長的條件可以防止菌種退化，如低溫、干燥、缺氧等。在棲土曲霉3．942 的培養(yǎng)中，有人曾用改變培養(yǎng)溫度的措施（從20-30℃提高到33-34℃）來防止它產(chǎn)孢子能力的退化。
控制傳代次數(shù) 由于微生物存在著自發(fā)突變，而突變都是在繁殖過程中發(fā)生而表現(xiàn)出來的。所以應(yīng)盡量避免不必要的移種和傳代，把必要的傳代降低到zui低水平，以降低自發(fā)突發(fā)的機率。菌種傳代次數(shù)越多，產(chǎn)生突變的幾率就越高，因而菌種發(fā)生退化的機會就越多。這要求不論在實驗室還是在生產(chǎn)實踐上，必須嚴(yán)格控制菌種的移種傳代次數(shù)，并根據(jù)菌種保藏方法的不同，確立恰當(dāng)?shù)囊品N傳代的時間間隔。如同時采用斜面保藏和其它的保藏方式（真空凍干保藏、砂土管、液氮保藏等），以延長菌種保藏時間。
利用不同類型的細(xì)胞進行移種傳代 在有些微生物中，如放線菌和霉菌，由于其菌的細(xì)胞常含有幾個核或甚至是異核體，因此用菌絲接種就會出現(xiàn)不純和衰退，而孢子一般是單核的，用它接種時，就沒有這種現(xiàn)象發(fā)生。有人在實踐中發(fā)現(xiàn)構(gòu)巢曲霉如用分生孢子傳代就容易退化，而改用子囊孢子移種傳代則不易退化；還有人采用滅過菌的棉團輕巧地沾取“5406”孢子進行斜面移種，由于避免了菌絲的接入，因而達(dá)到了防止退化的效果。
采用有效的菌種保藏方法 用于工業(yè)生產(chǎn)的一些微生物菌種，其主要性狀都屬于數(shù)量性狀，而這類性狀恰是zui容易退化的。因此，有必要研究和制定出更有效的菌種保藏方法以防止菌種退化。
1.4. 退化菌種的復(fù)壯
退化菌種的復(fù)壯可通過純種分離和性能測定等方法來實現(xiàn)，其中一種是從退化菌種的群體中找出少數(shù)尚未退化的個體，以達(dá)到恢復(fù)菌種的原有典型性狀。另一種是在菌種的生產(chǎn)性能尚未退化前就經(jīng)常而有意識地進行純種分離和生產(chǎn)性能的測定工作，以達(dá)到菌種的生產(chǎn)性能逐步有所提高。所以這實際上是一種利用自發(fā)突變不斷從生產(chǎn)中進行選種的工作。具體的菌種的復(fù)壯措施如下：
純種分離 采用平板劃線分離法、稀釋平板法或涂布法均可。把仍保持原有典型優(yōu)良性狀的單細(xì)胞分離出來，經(jīng)擴大培養(yǎng)恢復(fù)原菌株的典型優(yōu)良性狀，若能進行性能測定則更好。還可用顯微鏡操縱器將生長良好的單細(xì)胞或單孢子分離出來，經(jīng)培養(yǎng)恢復(fù)原菌株性狀。
通過寄主進行復(fù)壯 寄生型微生物的退化菌株可接種到相應(yīng)寄主體內(nèi)以提高菌株的活力。
聯(lián)合復(fù)壯 對退化菌株還可用高劑量的紫外線輻射和低劑量的DTG聯(lián)合處理進行復(fù)壯。
菌株 突變 退化 復(fù)壯