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PCR產(chǎn)物的直接測(cè)序
最近更新時(shí)間：2012-11-21
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詳細(xì)介紹：
PCR產(chǎn)物的直接測(cè)序
1.凝膠純化PCR擴(kuò)增的靶序列
如果*PCR反應(yīng)條件不能產(chǎn)生所需的特異性產(chǎn)物，可采用新的寡核苷酸重新進(jìn)行擴(kuò)增，或用凝膠電泳來分離不同的PCR產(chǎn)物，而后再各自重新擴(kuò)增進(jìn)行序列分析。長(zhǎng)度不同的片段可以用瓊脂糖凝膠電泳來分離:
1.片段大小在80-100bp時(shí)，可采用3%NuSieve1%普通瓊脂糖或用聚丙烯酰胺膠來分離。
2.從膠上切下含所南非PCR片段的薄片。
3.加入50∽100μlTE浸泡膠片，可反復(fù)凍融或放置幾個(gè)小時(shí)使DNA從膠中擴(kuò)散出來。
4.取少量（1-5%）進(jìn)行第二次擴(kuò)增，為得到純凈單一的產(chǎn)物，用于第二次PCR擴(kuò)增 的凝膠抽提物的量必須少于1ng。
5.現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)瓊脂糖含有抑制Tab聚合酶活的物質(zhì)。因而，如需重新擴(kuò)增供Tab聚合 酶測(cè)序用的片段，用丙烯酰胺電泳分離。
當(dāng)用PCR引物擴(kuò)增幾個(gè)同樣長(zhǎng)度的相關(guān)序列時(shí)，如來自幾個(gè)新近復(fù)制的基因，或重復(fù)序列或保守的信號(hào)序列（conserved signal sequences）的同樣顯子，可以通過下列兩種不同方法來改進(jìn)電泳分離。
1）.先用只切割某一模板的內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，而后電泳純化完整的PCR產(chǎn)物。
2）.用可使核苷酸序列不同的擴(kuò)增產(chǎn)物分開的電泳系統(tǒng)。下一個(gè)部份將討論此類系統(tǒng)中的變性甲酰胺梯度凝膠系統(tǒng)。采用方法一時(shí)，必須事先了解在不同PCR產(chǎn)物中的內(nèi)切酶位點(diǎn)。
2.雜合體的直接測(cè)序
當(dāng)兩個(gè)等位基因由于單一位點(diǎn)突變而產(chǎn)生差異時(shí)，用一個(gè)PCR引物直接進(jìn)行測(cè)序，能找出雜合位點(diǎn)。但是，帶有幾個(gè)點(diǎn)突變或短片段的插入/缺失的等位模板用PC R引物之一來直接測(cè)序，將產(chǎn)生復(fù)合序列帶（compound sequencing ladders）。
當(dāng)兩個(gè)等位基因由于單一位點(diǎn)突變而產(chǎn)生差異時(shí)，用一個(gè)PCR引物直接進(jìn)行測(cè)序，能找出雜合位點(diǎn)。但是，帶有幾個(gè)點(diǎn)突變或短片段的插入/缺失的等位模板用PC R引物之一來直接測(cè)序，將產(chǎn)生復(fù)合序列帶（compound sequencing ladders）。
有四種方法可以確定幾種點(diǎn)突在型并從雜合體中獲得單個(gè)等位基因的序列:
1）.克隆分離不同 的模板
2）.在測(cè)序之前，利用模板之間核苷酸序列的差異，用電泳技術(shù)分離不同的模板
3）.在測(cè)序反應(yīng)中只啟動(dòng)一個(gè)等位基因
4）.只擴(kuò)增一個(gè)等位基因
3.測(cè)序模板的制備
與PCR產(chǎn)物的直接測(cè)序有關(guān)的一些問題是變性后由于擴(kuò)增片段的兩條鏈可以迅速結(jié)合起來，從而阻止了測(cè)序引物與它的互補(bǔ)序列退火，或阻止了引物──模板復(fù)合物的延伸。在測(cè)序反應(yīng)中，模板鏈重新結(jié)合使一小部份模析驂與測(cè)序從而弱化zui終的測(cè)序條帶。為減少此問題，可用改進(jìn)的標(biāo)準(zhǔn)雙鏈DNA測(cè)序法或用PCR制備單鏈模板。
.雙鏈DNA模板
.雙鏈DNA模板
有兩種不同方法用來制備測(cè)序用的模板，目前都已用來測(cè)定共價(jià)閉環(huán)雙鏈質(zhì)粒模板的序列。用這些方法來進(jìn)行PCR產(chǎn)物的測(cè)序通常是較困騅的，因?yàn)槎痰木€性模板比團(tuán)環(huán)質(zhì)粒的雙鏈更易于重新結(jié)合。在這兩種方法中，PCR片段可以由凝膠電膠或在電泳前*行旋轉(zhuǎn)透析（Spin-dialysis）純化。
1.在室溫下，模板先在0.2M NaOH中變性5分鐘，冰凍，加入0.4倍的5M醋酸銨 （pH7.5）來中和反應(yīng)。立即用四體積的無水乙醇沉淀DNA。在合適的退火溫度下，加入測(cè)序緩沖引物。
2.在95℃下保溫5分鐘來變性模板，冰浴（或在干冰乙醇中）快速冷卻離心管，以減少鏈的重新結(jié)合。加入測(cè)序引物并使反應(yīng)達(dá)到合適的溫度。測(cè)序引物在變性前或后加入都合適。
單鏈DNA模板
單鏈DNA模板
使用單鏈模板可以避免測(cè)序中鏈的重新結(jié)合。單鏈模板可以從雙鏈DNA模板經(jīng)鏈分離凝膠中制備，或用PCR反應(yīng)制備。大于500bp的單鏈DNA片段，可從瓊脂糖凝膠中分離笪到，但它不適合于更短的單鏈。制備單鏈DNA的另一種不同方法是在PCR反應(yīng)中使用一個(gè)*標(biāo)記的引物，變性后的PCR產(chǎn)物經(jīng)過一個(gè)親合素柱而使兩條鏈得到分離，只有*標(biāo)記的鏈才可結(jié)合到柱上。
然而，zui簡(jiǎn)單的方法是用改進(jìn)的PCR方法，用此方法制備既定的單鏈DNA。在這個(gè)反應(yīng)中（不對(duì)稱PCR，asymmetric PCR），在開始的20-25個(gè)循環(huán)中，兩個(gè)比率不對(duì)稱的擴(kuò)增引物產(chǎn)生出雙鏈DNA，當(dāng)*的那個(gè)引物耗光后，隨后的5-10個(gè)循環(huán)就產(chǎn)生出ssDNA。單鏈DNA在約在25個(gè)循環(huán)后開始出現(xiàn)，這時(shí)*的引物也幾乎耗盡。經(jīng)過一個(gè)短暫快速上升后，ssDNA就開始如預(yù)期的那樣呈線性積累，這時(shí)反應(yīng)中僅有一個(gè)引物存在。各種比率的引物都以這種形式產(chǎn)生 ssDNA。一般對(duì)100μlPCR反應(yīng)體系而言，引物比率為50pmo:0.5pmol，經(jīng)過30個(gè)循環(huán)后，大約可產(chǎn)生1-3pmol的ssDNA。
ssDNA的產(chǎn)量可用下列幾種方法來估計(jì):a）。在PCR 反應(yīng)中，除了加入正常數(shù)量的dDNA外，還加入32P-dNTP。取10%的反應(yīng)產(chǎn)物在薄的3% NuSieve+1%普通瓊脂糖凝膠中電泳，干燥并與膠片一起曝光。b）.取5%的反應(yīng)物來走 膠，轉(zhuǎn)移到膜上，并用與ssDNA互補(bǔ)的寡核苷酸為探針雜交。ssDNA不能用EB染色來定 量，因?yàn)閟sDNA有形成二級(jí)結(jié)構(gòu)的趨勢(shì)且染料的插入在模板中是隨機(jī)的。使用不對(duì)稱引物比例的擴(kuò)增效率比兩種引物均過量80-90%）的擴(kuò)增效率低（70%）。
在實(shí)驗(yàn)中，這可通過增加PCR循環(huán)的次數(shù)來彌補(bǔ)。若不對(duì)稱的PCR反應(yīng)不能產(chǎn)生足夠數(shù)量的ssDNA，可以試一試不同的引物比率;b）.再加5-10個(gè)PCR循環(huán);c）.在zui后五個(gè)循環(huán)中多加Tab聚合酶（2U）;d）.試一下相反的不對(duì)稱引物比率。有時(shí)，相反的不對(duì)稱引物比率可能給出不同產(chǎn)量的ssDNA。制備出的單鏈DNA用*的那個(gè)PCR引物或用一個(gè)內(nèi)引物來測(cè)序，并應(yīng)用常規(guī)方法進(jìn)行摻入測(cè)序（incorporation sequencing）或標(biāo)記引物測(cè)序。制備出的 ssDNA鏈可能有一個(gè)不連續(xù)的5-末端，但可能在靠近3-末端不同位點(diǎn)處被切去，這是由于延伸過程中終止過早所產(chǎn)生的。然而，對(duì)于測(cè)序反應(yīng)中所使用的任何一種引物，只有完整的ssDNA可以用作測(cè)序模板。
zui近還報(bào)道了另一種方法制備單鏈核酸模板進(jìn)行直接測(cè)序。這種方法包括在一個(gè) PCR引物上加入噬菌體的啟動(dòng)子，轉(zhuǎn)錄出該PCR產(chǎn)物的RNA拷貝，再用反轉(zhuǎn)錄酶不測(cè)序。但由于擴(kuò)增反應(yīng)后附加了一個(gè)酶促反應(yīng)步驟和限于用反轉(zhuǎn)錄酶作為測(cè)序酶，這種方法的應(yīng)用受到很大的限制。
4.用不耐熱DNA聚合酶進(jìn)行PCR產(chǎn)物的測(cè)序
4.用不耐熱DNA聚合酶進(jìn)行PCR產(chǎn)物的測(cè)序
一些不耐熱DNA聚合酶已經(jīng)用來直接測(cè)序體外擴(kuò)增的DNA。使用Klenow聚合酶，修飾T7DNA聚合酶（測(cè)序酶）及反轉(zhuǎn)錄酶來測(cè)序。
用Taq聚合酶進(jìn)行PCR產(chǎn)物的測(cè)序