【實驗?zāi)康摹?/div>
1、 了解原代細胞培養(yǎng)的基本方法及操作過程。
2、 學習細胞計數(shù)、營養(yǎng)液的配制等，初步掌握無菌操作方法。
3、了解細胞損傷的過程及死活細胞的鑒定方法。
【實驗原理】
（一） 細胞原代培養(yǎng)
原代細胞培養(yǎng)是指直接從動物體內(nèi)獲取的細胞、組織和器官，經(jīng)體外培養(yǎng)后，直到*次傳代為止。這種培養(yǎng)，首先用無菌操作的方法，從動物體內(nèi)取出所需的組織（或器官），經(jīng)消化，分解成單個游離細胞，在人工培養(yǎng)下，使其不斷的生長及繁殖。
細胞培養(yǎng)是一種操作繁瑣而又要求十分嚴謹?shù)膶嶒灱夹g(shù)。要使細胞能在體外長期生長，必須滿足兩個基本要求：一是供給細胞存活所必須的條件，如適量的水、無機鹽、氨基酸、維生素、葡萄糖及其有關(guān)的生長因子、氧氣、適宜的溫度，注意外環(huán)境酸堿度與滲透壓的調(diào)節(jié)。二是嚴格控制無菌條件。
（二） 細胞死活鑒定
在顯微鏡下活細胞細胞膜完整、立體感強，胞質(zhì)透明度好，顆粒狀物質(zhì)少;死細胞膜破裂，無立體感，細胞通透性差，有顆粒狀物質(zhì)、空泡。
培養(yǎng)好的細胞培養(yǎng)液顏色呈土黃色，透明度好，不渾濁，發(fā)亮，有渾濁可能是污染初期或細胞太多。
染色排除法是生物研究中判斷細胞活性的一種常用方法，簡便，易于操作實驗是利用了死活細胞在生理機能和性質(zhì)上的差異來進行的。原理：因為活細胞的細胞膜具有選擇透過性，細胞不需要的物質(zhì)通常不能進入細胞，染色劑中如臺盼藍就不能進入細胞，因此用該染色劑處理細胞后，細胞不會被染色，由于死細胞的細胞膜是全透性的，因此臺盼藍能進入死細胞，從而可以使死細胞染色。依此染色便可以判斷細胞的活性。
活細胞必需通過控制物質(zhì)進出細胞膜來保持內(nèi)部生理環(huán)境的穩(wěn)定性。細胞死后，細胞膜通透性發(fā)生改變，原先不能進入細胞的物質(zhì)也能夠進入細胞。常見的細胞燃料有：中性紅、臺盼藍、甲基藍、美藍、熒光素雙醋酸酯等。臺盤藍染料正常情況下被活細胞阻攔在細胞膜外，只有細胞膜受損或者細胞死亡后，才能進入細胞，從而與解體的DNA結(jié)合，使其著色，因此，活細胞一般不能被臺盤藍染色，而死細胞會被染成藍色。通過顯微鏡很容易就能識別出死亡被染色的細胞，并可用細胞計數(shù)板進行計數(shù)。伊紅和蘇木精是zui常用的細胞染色劑。伊紅在很多生物技術(shù)中都有應(yīng)用。伊紅有自發(fā)熒光特性。懸液中細胞的計數(shù)，往往采用*。
熒光排除法 生活力強的細胞能發(fā)出強烈的黃綠色熒光;生活力的細胞發(fā)出熒光也較弱;死亡細胞無熒光。
【實驗器材】
解剖剪，解剖鑷，棉球，培養(yǎng)皿，酒精燈，75%酒精，移液槍，無菌操作臺，培養(yǎng)箱，正置光學顯微鏡，倒置光學顯微鏡，吸管，解剖盤，滴管，離心管，離心機，注射器，塑料培養(yǎng)皿，載玻片，蓋玻片，*等。
【實驗材料】
小鼠1只，細胞培養(yǎng)液（含生長因子），Trypen Blue染液，PBS緩沖液
【實驗步驟】
（一） 細胞的原代培養(yǎng)
1. 取材：
取小鼠一只，采用斷頭法處死。清水洗小鼠浸入75%酒精中消毒3min，取出轉(zhuǎn)入超凈工作臺內(nèi)的解剖盤中，無菌操作打開腹腔，取出其脾臟，除去其周圍的脂肪組織，并用PBS液自上而下淋洗1-2次，轉(zhuǎn)入無菌培養(yǎng)皿中待用。
2. 分離脾細胞：
用滴管向培養(yǎng)皿中注入30滴PBS緩沖液，再用’L’型針頭注射器在皿中吸取0.2毫升PBS液注入脾臟，注射時沿長軸注射。然后再用針頭在脾臟上扎眼，并用’L’型針頭輕輕刮出脾細胞。在均勻吹勻脾臟細胞。
吸取上述分離的單個脾細胞懸液，放入Eppendorf管中，使量至1mL，以1000r/min離心5min。
3. 培養(yǎng)脾細胞：
取塑料培養(yǎng)皿一套，用移液槍吸取培養(yǎng)液2mL加入塑料皿中，并將皿標記待用。取離心后的Eppendorf管，棄去上清液，用移液槍（200ul）吸取塑料皿中的培養(yǎng)液400ul加入棄去上清的Eppendorf管中，用槍頭吹勻管底的脾細胞，吸取200ul脾細胞懸液接種于上述塑料皿中，混勻后放入37°C，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
（二） 細胞死活鑒定及計數(shù)
1. 試劑配制：用生理鹽水配成4%Tyrpen Blue染液，備用。
2. 染色計數(shù)：
取0.5mL細胞懸濁液放入試管中，加入1-2滴染液?；旌?。2min后將細胞放在*上觀察死活情況。
3. 計數(shù)：
在10x10倍的顯微鏡下觀察，計算*的中間方格四角和中間5個小方格的細胞數(shù)量。包括細胞總數(shù)與死細胞數(shù)量。壓線者計上不計下，計左不計右。
4. 計算細胞活力：
根據(jù)公式：
活細胞率（%）={（細胞總數(shù)—死細胞數(shù)）細胞總數(shù)}*100%
【實驗結(jié)果】
Tyrpen Blue染液，活細胞不會被染色而呈無色，死細胞會被其染色而呈藍色。
顯微鏡下觀察結(jié)果：
表格
計算結(jié)果：
死細胞 個ml
活細胞 ml
活細胞率 %
死細胞率 %
細胞活力 %
【注意事項】
1、嚴格進行動物消毒，需用75%酒精消毒。
2、嚴格進行無菌操作，防止細菌、霉菌、支原體污染，避免化學物質(zhì)污染。
3、吸取液體前，瓶口和吸管硬行火焰消毒;吸取液體時，避免碰撞。
4、離心管入臺前，管口、管壁應(yīng)消毒。
5、實驗者離開超凈臺時，要隨時用肘部關(guān)閉工作窗。
6、器材使用時既要注意用火焰消毒，又要防止燙傷、燙死細胞。
【分析總結(jié)】
染色時間過長，或觀察時間過長都會導致染色試劑將細胞殺死，使細胞活力驟降。
