凱氏定氮法測定蛋白質(zhì)含量具有一定的準(zhǔn)確度，在物質(zhì)蛋白含量的測定中運(yùn)用比較廣泛。但凱氏定氮法也存在著一些不足之處，如消化時(shí)間長、環(huán)境污染大、滴定終點(diǎn)不易控制等。鑒于此，在傳統(tǒng)凱氏定氮法的基礎(chǔ)上，對試驗(yàn)裝置如如蛋白質(zhì)測定儀和操作方法進(jìn)行一些改進(jìn)，可以大大提高測定蛋白質(zhì)的效率，并且降低了測定過程中對空氣的污染。
凱氏定氮法的原理如下：總共包括四個步驟消化、蒸餾、吸收和滴定。首先消化過程為將含氮化合物和濃硫酸共熱，將有機(jī)氮轉(zhuǎn)化為無機(jī)氮硫酸銨，具體方程式為2NH2+H2S04+2H＝（NH4）2S04（其中CuSO4做催化劑）。之后就是蒸餾和吸收，將消化完的樣品轉(zhuǎn)移到定氮儀蒸餾裝置，加入過量的濃氫氧化鈉，將NH4+轉(zhuǎn)變成NH3，通過蒸餾把NH3驅(qū)入過量的硼（禁詞）酸溶液接受瓶內(nèi)，硼（禁詞）酸接受氨后，形成四硼（禁詞）酸銨。此過程用公式表示為（NH4）2SO4+2NaOH＝2NH3+2H2O+Na2SO4 2NH3+4H3BO3＝（NH4）2B4O7+5H2O。 zui后一步驟為滴定，用標(biāo)準(zhǔn)鹽酸滴定，直到硼（禁詞）酸溶液恢復(fù)原來的氫離子濃度。此時(shí)反應(yīng)式為（NH4）2B4O7+2HCl+5H2O＝2NH4Cl+4H3BO3。這樣，整個凱氏定氮法的過程，就通過這幾個方程式，全部體現(xiàn)出來了。
而對于凱氏定氮法的改進(jìn)，主要體現(xiàn)在：1.消化裝置的組裝：將原微量凱氏定氮法需要固定的凱氏燒瓶換成不需要固定的250mL的錐形瓶，同時(shí)在瓶口倒置一漏斗，漏斗頸頂部用玻璃彎管連接，彎管再用導(dǎo)管與內(nèi)盛稀堿溶液的大燒杯相連。2.消化過程：將樣品放入錐形瓶中，然后加入濃硫酸，當(dāng)裝置安裝完畢后，放在通風(fēng)櫥中，打開電爐，對燒瓶直接加熱，進(jìn)行消化。起初用小火并隨時(shí)調(diào)節(jié)火的大小，使產(chǎn)生的煙氣被堿液*吸收；待內(nèi)容物全部炭化，泡沫*停止后加強(qiáng)火力，隨時(shí)轉(zhuǎn)動燒瓶，使瓶壁上的內(nèi)容物全部回流入消化液中，燒至溶液透明，沉淀灰白，取下待冷。3.測定過程：在100mL錐形瓶內(nèi)加入15mL體積分?jǐn)?shù)為1%硼（禁詞）酸吸收液，置于冷凝器下，并使管口浸入硼（禁詞）酸內(nèi)，夾緊放氣口，取10mL樣品稀釋液或空白液由進(jìn)樣口注入反應(yīng)室。以5mL蒸餾水沖洗樣口，用量筒量取5mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)25%NaOH，迅速倒入進(jìn)樣口，并立即塞好，加水于進(jìn)樣口，以防氨逸出，從第1滴溜液滴下開始計(jì)時(shí)，蒸餾3min，移動吸收瓶，使硼（禁詞）酸液面離開冷凝管口，再蒸餾1min，然后用少量蒸餾水沖洗冷凝管下端，從而保證了游離氨被*蒸餾接收。此時(shí)我們要確定氨氣*被吸收記錄下消耗的酸的體積。此時(shí)繼續(xù)夾緊排氣口，提起進(jìn)口塞，使蒸餾水流入反應(yīng)室，捏緊進(jìn)氣橡皮管，以斷絕蒸汽源。這時(shí)反應(yīng)室中的廢液被自動吸出，如此反復(fù)沖洗干凈反應(yīng)室，將排氣閥打開，使反應(yīng)室外層中的廢液排出。
對于凱氏定氮法進(jìn)行改進(jìn)后，能提高定氮的效率，同時(shí)減少污染，而且操作更加簡單。另外，其測定結(jié)果跟用全自動定氮儀測出來的結(jié)果幾乎沒有差別。因此，我們在測定蛋白質(zhì)含量或者氮元素含量的時(shí)候，需要慎重選擇測定方法，以提高其測定結(jié)果度以及測定效率。
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