一.*，要用Western Blot比較不同條件下或者不同組織中，目的蛋白表達(dá)量的相對(duì)多少，前提條件是等量的蛋白上樣，才有比較的基礎(chǔ)。特別是在表達(dá)量不高時(shí)，上樣量的差別就很可能影響結(jié)果的分析。所以需要內(nèi)參做對(duì)比。
內(nèi)參即是內(nèi)部參照（Internal Control），對(duì)于哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)來(lái)說(shuō)一般是指由管家基因編碼表達(dá)的蛋白(Housekeeping Proteins)，它們?cè)诟鹘M織和細(xì)胞中的表達(dá)相對(duì)恒定，在檢測(cè)蛋白的表達(dá)水平變化時(shí)常用它來(lái)做參照物。在Western Blotting 實(shí)驗(yàn)中，除了需要進(jìn)行蛋白抽提、蛋白定量、等量蛋白上樣電泳、轉(zhuǎn)膜、靶蛋白抗體孵育、顯色等步驟以外，還需要進(jìn)行內(nèi)參的檢測(cè)，以校正蛋白質(zhì)定量、上樣過(guò)程中存在的實(shí)驗(yàn)誤差，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。
在國(guó)外發(fā)表的文章中，Western Blotting 實(shí)驗(yàn)結(jié)果須進(jìn)行內(nèi)參校正已成為一種慣例。但是，國(guó)內(nèi)仍有不少科研人員在Western Blotting實(shí)驗(yàn)中忽略了內(nèi)參的使用，將蛋白濃度測(cè)定作為規(guī)范需相互比較的各種樣品間上樣量等同的*方法。然而各種蛋白質(zhì)濃度定量方法，都存在局限性，不能*準(zhǔn)確的確定各種樣品的準(zhǔn)確蛋白濃度。 蛋白質(zhì)定量以后進(jìn)行電泳時(shí)需要等量上樣，此步驟也存在操作誤差。在Western blotting實(shí)驗(yàn)時(shí)使用內(nèi)參，即可簡(jiǎn)便地對(duì)定量和上樣步驟產(chǎn)生的誤差進(jìn)行校正。此外使用內(nèi)參可以作為空白對(duì)照，檢測(cè)蛋白轉(zhuǎn)膜情況是否*、整個(gè)Western Blot顯色或者發(fā)光體系是否正常。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析其實(shí)很簡(jiǎn)單：如果樣品蛋白量有限，只夠進(jìn)行一次電泳轉(zhuǎn)膜實(shí)驗(yàn)時(shí)，分別檢測(cè)樣品的內(nèi)參量和目的蛋白量。將各樣品目的蛋白量分別除以其內(nèi)參含量，得到的數(shù)值即為內(nèi)參校正后的各樣品中目的蛋白相對(duì)含量，再用此數(shù)值進(jìn)行樣品間的比較和分析，得到目的蛋白含量在不同樣品間的實(shí)際變化結(jié)果。如果樣品量充分，可以先檢測(cè)內(nèi)參，觀測(cè)樣品間內(nèi)參顯色條帶是否一致，根據(jù)差異大小調(diào)整各樣品的上樣量重新進(jìn)行Western Blotting實(shí)驗(yàn)，至內(nèi)參量一致為止；若內(nèi)參一致，即可進(jìn)行不同樣品間目的蛋白表達(dá)變化分析。這樣雖然麻煩一點(diǎn)，但是可以保證結(jié)果更有說(shuō)服力，更可信。畢竟我們的實(shí)驗(yàn)是一種嚴(yán)謹(jǐn)?shù)墓ぷ鳌?br />二.實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)的問(wèn)題及處理辦法
1、為什么帶出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象？
原因：主要是樣品融解效果不佳或分離膠濃度過(guò)大引起的；
處理辦法：加樣前離心，選擇適當(dāng)?shù)臉悠肪彌_液，加適量樣品促溶劑；電泳緩沖液時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，重新配制;降低凝膠濃度。
2、為什么帶出現(xiàn)紋理現(xiàn)象？
原因：主要是樣品不溶性顆粒引起的；
處理辦法：加樣前離心，加適量樣品促溶劑。
3、為什么電泳的條帶很粗？
原因：電泳中條帶很粗是常見(jiàn)的事，主要是未濃縮好的原因；
處理辦法：適當(dāng)增加濃縮膠的長(zhǎng)度，保證濃縮膠貯液的pH正確（6.7），適當(dāng)降低電壓。