細(xì)胞實(shí)驗(yàn)技術(shù)匯總-細(xì)胞組分的化學(xué)反應(yīng)
【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/span>

了解核酸、蛋白質(zhì)、糖及酶的細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)原理，掌握 Brachet 反應(yīng)及堿性蛋白、酸

性蛋白、糖原和過氧化物酶的細(xì)胞化學(xué)染色方法。

【實(shí)驗(yàn)用品】

一、材料和標(biāo)本 蟾蜍、小白鼠各一只、肝臟石臘切片、培養(yǎng)的 Hela 細(xì)胞。

二、器材和儀器 光學(xué)顯微鏡、解剖器材、蠟盤、載玻片、吸水紙、染色缸、蓋玻片、

水浴箱。

三、試劑 PBS 緩沖液（pH7.2）、甲基綠一呱咯寧醋酸緩沖液、純丙酮、l/2 丙酮+1/2 二

甲苯、純二甲苯、70％乙醇、5％三氯醋酸、0.1％堿性固綠、0.1％酸性固綠、0.5％硫酸

銅、聯(lián) 苯胺混合液、1 ％番紅、無 水乙醇、過 碘酸酒精液、S chiff 氏酒精液、亞 硫酸水、E hrlieh

蘇木精、95％乙醇、Carnoy 固定液（甲醇：冰醋酸=3:1，體積比）

【實(shí)驗(yàn)內(nèi)容】

細(xì)胞的組織化學(xué)方法，是研究細(xì)胞成分常用的方法之一。它是利用化學(xué)試劑與細(xì)胞內(nèi)

的某些物質(zhì)進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)，從而在細(xì)胞局部形成有色沉淀物，再通過顯微鏡對(duì)組織內(nèi)的生

物化學(xué)成分進(jìn)行定性、定位、定量研究。

一、Brachet 反應(yīng)一顯示細(xì)胞內(nèi)的 DNA 和 RNA

（一）原理

細(xì)胞經(jīng)甲基綠一呱咯寧混合液處理后，其中的 DNA 和 RNA 出現(xiàn)不同的呈色反應(yīng)，一般

認(rèn)為這是由于帶有負(fù)電荷的核酸對(duì)堿性染料呱咯寧和甲基綠具有親和力，且這兩種染料的

作用有選擇性，甲基綠染高聚分子的 DNA 呈藍(lán)綠色，呱咯寧染低聚分子的 RNA 呈紅色。由

此對(duì)細(xì)胞中的 DNA 和 RNA 進(jìn)行定位、定性、和定量分析。

（二）方法

l．接種 Hela 細(xì)胞于蓋片上并培養(yǎng) 24～48 小時(shí)，使長(zhǎng)成單層。

2．取出蓋片，用 PBS（pH7.2）輕輕沖洗蓋片表面去除殘?jiān)?/font>

3．放入 Carnoy 固定液中固定 l 小時(shí)。

4．浸入甲基綠一呱咯寧醋酸緩沖液中 30 分鐘染色。

5．取出蓋片放入蒸餾水中輕輕漂洗 2～3 次（2～3 秒鐘左右），吸去水分。放入純丙酮

中分色 2～3 秒鐘。

6. 放入 l／2 丙酮+1／2 二甲苯中 5 秒鐘。

7．放入純二甲苯中透明 5 分鐘。

8．滴一滴中性樹膠于載玻片上，將蓋片標(biāo)本面朝下封片。

9．鏡下觀察

（三）結(jié)果

細(xì)胞質(zhì)被染成淺紅色，細(xì)胞核被染成藍(lán)綠色，而其中核仁被染成紫紅色（參照照片）。

二、細(xì)胞內(nèi)堿性蛋白和酸性蛋白的顯示

（一）原理

由于不同的蛋白質(zhì)分子所帶的堿性和酸性基團(tuán)的數(shù)目不同，在 pH 值不同的溶液中，蛋

白質(zhì)分子所帶的凈電荷多少不同。如在生理?xiàng)l件下，整個(gè)蛋白質(zhì)所帶負(fù)電荷多，則為酸性

蛋白質(zhì)；帶正電荷多，則為堿性蛋白質(zhì)。據(jù)此，可將標(biāo)本經(jīng)三氯醋酸處理提出核酸后，用

不同 pH 值的固綠染液分別染色，細(xì)胞內(nèi)的酸性蛋白和堿性蛋白質(zhì)顯示出來。

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（二）方法

1．以破壞脊髓法處死蟾蜍，將其腹面向上放人蠟盤中，剪開胸腔，打開心包。小心將

心臟剪一小口，取心臟血一滴滴在干凈載玻片一端，推片，按此法制備二張血涂片，室溫

晾干。

2. 將涂片作好標(biāo)記放在 70％乙醇中固定 5 分鐘，室溫晾干。

3．放入 5％三氯醋酸中 60℃30 分鐘，抽提出核酸。

4．清水沖洗多次（3 分鐘以上），以沖去痕跡的三氯醋酸。

5．濾紙吸干玻片上水分。

6. 一張片放入 0.1％堿性固綠（pH8.0～8.5）中染色 10～15 分鐘,另一張片放入 0.1％

酸性固綠（pH2.0～2.5）染色 5～10 分鐘。

7．清水沖洗，蓋上蓋片鏡檢。

（三）結(jié)果

經(jīng)堿性固綠染色片中，胞質(zhì)、核仁不著色，細(xì)胞核大部分被染成綠色，是為堿性蛋白

質(zhì)存在處（參照照片）。經(jīng)酸性固綠染色片中，因胞質(zhì)和核仁中有酸性蛋白，被染成綠色。

三、細(xì)胞內(nèi)過氧化物酶的顯示

（一）原理

過氧化物酶能把許多胺類氧化為有色化合物，用聯(lián)苯胺處理標(biāo)本，細(xì)胞內(nèi)的過氧化物

酶能把聯(lián)苯胺氧化為藍(lán)色的聯(lián)苯胺藍(lán)，進(jìn)而變?yōu)樽厣a(chǎn)物，因而可以根據(jù)顏色反應(yīng)來判定

過氧化物酶的有無或多少。

（二）方法

1．取小鼠一只，以頸椎脫位法將其處死，迅速剖開其后肢暴露出股骨，將股骨一端斜

向剪斷，用 PBS 緩沖液濕潤(rùn)過的注射器針頭吸出骨髓一滴滴到載玻片上。

2．推片，室溫晾干。

3．將涂片放入 0.5％硫酸銅中浸 30 秒~1 分鐘。

4．取出涂片直接放入聯(lián)苯胺混合液中反應(yīng) 6 分鐘。

5．清水沖洗，放入 1％番紅溶液中復(fù)染 2 分鐘。

6．清水沖洗，室溫晾干。

7．鏡檢或封片后鏡檢。

（三）結(jié)果

涂片中可見一些細(xì)胞中存在著藍(lán)色或棕色顆粒，為過氧化物酶所在位置。

四、過碘酸雪夫反應(yīng)（PAS）——顯示細(xì)胞內(nèi)糖原（參照照片和示教片）

（一）原理

組織、細(xì)胞的多糖、粘多糖及粘蛋白等都可用 PAS 法來顯示，其化學(xué)基礎(chǔ)是利用過碘

酸的氧化作用，打開碳鏈形成醛，生成的醛基與 Schiff 試劑中的無色品紅反應(yīng)形成紫紅色

化合物。

（二）方法

l．取 l~2mm 厚的肝組織塊，用 Carnoy 氏液 4℃固定 4～6 小時(shí)。

2．乙醇脫水、二甲苯透明。石蠟包埋，切片。

3．用 70％乙醇展片。

4．脫蠟：二甲苯（1）5 分鐘→二甲苯（2）5 分鐘→100％乙醇 5 分鐘→含 1％火棉膠的乙

醇液 1 分鐘→70％乙醇 1 分鐘。

5．直接浸入過碘酸酒精液反應(yīng) 5～15 分鐘，經(jīng) 70％乙醇洗片刻。

6．浸入 Schiff 氏酒精液反應(yīng) 15 分鐘。

7．亞硫酸水洗三次，以洗去多余的非特異性結(jié)合的色素，以及擴(kuò)散的染料。

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8．流水沖洗 3～5 分鐘。

9．蒸餾水洗。

10．浸入 Ehrlich 蘇木精復(fù)染 20~30 秒，使細(xì)胞核著色。

11．脫水：95％乙醇 3 分鐘二次→100％乙醇 3 分鐘二次→二甲苯透明 10 分鐘二次。

12．加蓋片鏡檢或樹膠封固后鏡檢。

（三）結(jié)果

細(xì)胞中呈紫紅的顆粒即為糖原（參照照片）。

五、蘇丹Ⅲ染色——顯示細(xì)胞內(nèi)脂肪（示教片）

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