標(biāo)記抗體：熒光素標(biāo)記ATP結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)因子1抗體IgG
1．用無(wú)水DMSO配制10mg/ml*N-羥基琥珀酰亞胺酯溶液。

2．用硼酸鹽緩沖液（0.1mol/L, pH8.8）配制濃度至少為1～3mg/ml的抗體溶液，若抗體儲(chǔ)存時(shí)加入了疊氮鈉，則標(biāo)記前須先在硼酸鹽緩沖液中充分透析以除去疊氮鈉。

3．按25～100μg/mg的比率將*酯加入抗體中，混合均勻并在室溫下孵育4h。在完成結(jié)合反應(yīng)之前DMSO的終濃度不能低于5％，否則*酯會(huì)出現(xiàn)沉淀。高濃度的*酯會(huì)導(dǎo)致多個(gè)*分子結(jié)合在抗體上，因此可能會(huì)使所有抗體都被標(biāo)記。較低的比率則會(huì)是使*化保持在zui低限度（25μg*酯/mg抗體的zui初摩爾比為10：1）。

4．每250μg*酯內(nèi)加入20μl 1mol/L的氯化銨，室溫孵育10min。

5．將抗體溶液用PBS或其他所需的緩沖液透析，以除去未結(jié)合的*。由于*分子較大，故透析比預(yù)料中的要慢，或者用蛋白A或蛋白G層析柱再次純化抗體。

6．按純化抗體的儲(chǔ)存方法保存標(biāo)記抗體。
熒光素標(biāo)記ATP結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)因子1抗體IgG，放射性碘標(biāo)記抗體

1．在碘標(biāo)記之前，準(zhǔn)備氯甘脲包被的試管（2支6mm堿性玻璃管或1.5ml圓錐形試管）。將氯甘脲溶于濃度為0.5μg/ml的氯仿中。再將其分別加至試管中，每管100μl和20μl。讓氯仿在通風(fēng)櫥中揮發(fā)過(guò)夜。室溫儲(chǔ)存試管于干燥器中，可保存數(shù)年。包被有20μl氯甘脲的試管碘化效率較低，如果在平常的碘化反應(yīng)時(shí)引起抗體受損，則可用此試管。

2．在即將開(kāi)始碘化反應(yīng)之前，準(zhǔn)備好分離標(biāo)記抗體的凝膠層析柱。使用排阻限度為20 000～50 000供分離球形蛋白分子的凝膠介質(zhì)。選用中等粒度的凝膠微柱（直徑約100μm）。依照說(shuō)明書(shū)準(zhǔn)備裝有1ml體積凝膠微柱的濾柱，濾柱在標(biāo)記之后將丟棄，故應(yīng)選擇適合的濾柱。為了使碘化蛋白的非特異性結(jié)合減少到zui低，濾紙應(yīng)先用至少10倍體積的含0.02
疊氮鈉的1％ BSA/PBS淋洗，然后再用10倍體積的PBS淋洗濾柱以除去BSA。或者用含BSA的緩沖液膨脹凝膠粒，使用前再洗去BSA。讓濾柱內(nèi)緩沖液流出直至剛好低于柱床頂部，關(guān)閉凝膠柱底部的閥門(mén)或用塑膜黏土塞住膠柱末端。

3．在進(jìn)行碘化反應(yīng)之前即時(shí)準(zhǔn)備“終止”管，用于終止氧化反應(yīng)及滯留未參與結(jié)合反應(yīng)的剩余碘。于1.5ml錐形試管中加入50μl氯甘脲終止緩沖液（10mg/ml飽和的*、10％甘油和含0.1％二甲苯氰醇的PBS）。

4．室溫下在通風(fēng)櫥內(nèi)向氯甘脲包被管中加入50μl抗體。抗體用0.5mol/L磷酸鈉緩沖液（pH7.5）配制，濃度為0.2～1mg/ml。

5．于有抗體的氯甘脲試管中加入500μCi Na，將吸液頭丟入專門(mén)盛放廢棄125I材料的容器中。孵育2min，時(shí)間可稍延長(zhǎng)，但可能會(huì)增加抗體的氧化損傷。

6．用巴斯德移液管將試管中液體移至盛有50μl氯甘脲終止緩沖液的試管中，輕輕混合。將巴斯德移液管和氯甘脲包被管丟于放射性廢物容器中。

7．小心將終止管中的反應(yīng)混合物加到濾柱內(nèi)，并將移液管丟于放射性廢物容器中。

8．放開(kāi)濾柱的閥門(mén)，開(kāi)始收集洗脫液于1.5ml錐形試管中。在碘標(biāo)記蛋白流入凝膠微珠內(nèi)后，向?yàn)V柱內(nèi)小心加入0.3ml含0.02％疊氮鈉PBS。繼續(xù)收集洗脫液于*管中。當(dāng)緩沖液到達(dá)凝膠微珠頂部時(shí)，換用第二支錐形試管，然后再向?yàn)V柱內(nèi)加入0.3ml含0.02％疊氮鈉的PBS，再收集洗脫液。繼續(xù)重復(fù)上述洗脫步驟。用微型檢測(cè)儀監(jiān)測(cè)各管中125I標(biāo)記抗體和游離標(biāo)記物的波峰?？贵w應(yīng)出現(xiàn)在第2～4洗脫組分，明顯早于藍(lán)色的二甲苯藍(lán)氰醇，后者與游離標(biāo)記物一道洗脫。

9．將含有碘化抗體的洗脫組分合并。將未參與結(jié)合反應(yīng)的標(biāo)記物連同整個(gè)濾柱丟于放射性廢物容器中。

10．  標(biāo)記抗體可儲(chǔ)存于1％ PBS/BSA洗脫緩沖液中，放4℃保存。雖然抗體比較穩(wěn)定，但放射性碘并不穩(wěn)定。因此，標(biāo)記抗體應(yīng)在6周內(nèi)使用。
，生物合成法標(biāo)記單克隆抗體

1．標(biāo)記時(shí)雜交瘤細(xì)胞須生長(zhǎng)旺盛、快速增殖。離心（3000g，10min收集大約2×106個(gè)細(xì)胞。

2．用37℃預(yù)溫的不含蛋氨酸的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，洗滌一次，再離心300g，10min。

3．用不含蛋氨酸的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞至大約106/ml。加入[35S]蛋氨酸（每次標(biāo)記用100μCi）可獲得放射性強(qiáng)度約為105～106cpm的抗體。

4．于CO2培養(yǎng)箱中37℃孵育過(guò)夜。

5．將細(xì)胞懸液以1000g離心10min，得到密集的細(xì)胞沉淀。棄去上清液。加入1/20體積的1mol/L Tris（pH8.0）和疊氮鈉至0.02％。）

熒光色素標(biāo)記抗體

1．準(zhǔn)備好凝膠濾柱以便完成結(jié)合反應(yīng)后用于分離標(biāo)記抗體和游離的熒光色素。分離球形蛋白使用排除極限為20 000～50 000的凝膠介質(zhì)和細(xì)粒級(jí)凝膠（直徑約50μm）。所需凝膠濾柱的大小可根據(jù)偶聯(lián)反應(yīng)的總體積×20來(lái)確定。依據(jù)廠家說(shuō)明準(zhǔn)備好濾柱，用20倍柱床體積的 PBS灌注濾柱，直至緩沖液水平剛好降至低于柱床頂部，關(guān)閉濾紙底部的閥門(mén)或用塑膜黏土（或parafilm）封閉底端以使濾柱不再流動(dòng)。

2．用0.1mol/L的硼酸鈉或碳酸鈉配制濃度至少為2mg/ml的抗體溶液（pH9.0）。應(yīng)避免引入含一級(jí)胺的外來(lái)分子。

3．用無(wú)水DMSO（優(yōu)級(jí)純）溶解FITC或TRITC至1mg/ml。每次標(biāo)記反應(yīng)時(shí)新鮮配制。

4．每1ml蛋白溶液加50μl染液。染液須以每次5μl緩慢加入，加入時(shí)應(yīng)輕輕地連續(xù)攪拌混勻。

5．置4℃避光反應(yīng)1h。

6．加氯化銨至50mmol/L，室溫孵育2h。加入0.1％二甲苯氰和5％甘油。

7．通過(guò)凝膠過(guò)濾分離結(jié)合物與未結(jié)合的染料。小心地將偶聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)物加在濾柱頂部，打開(kāi)閥門(mén)使抗體溶液流過(guò)濾柱直至剛好進(jìn)入柱床。再小心地將PBS加在濾柱頂部并與緩沖液供應(yīng)裝置連接。結(jié)合染料的抗體首先洗脫，通?？稍谑夜庀乱?jiàn)到。

8．將洗脫液的結(jié)合物4℃貯存于避光容器，必要時(shí)加入0.02％疊氮鈉。

9． 進(jìn)行熒光素偶聯(lián)反應(yīng)時(shí)，應(yīng)通過(guò)測(cè)量495nm和280nm波長(zhǎng)的吸光值計(jì)算熒光素和蛋白的比率，羅丹明的測(cè)量波長(zhǎng)在550nm和280nm。熒光素的吸光 值比例（496nm/280nm）應(yīng)在0.3～1.0之間，羅丹明的吸光值比率（550nm/280nm）在0.3～0.7之間。低于上述比率將導(dǎo)致低信 號(hào)，高比率則出現(xiàn)高背景。若比率太低，應(yīng)使用低濃度抗體與高濃度染料重復(fù)結(jié)合；若比率太高，則可適當(dāng)調(diào)整后重新標(biāo)記，或通過(guò)DEAE離子交換層析柱進(jìn)一步 純化抗體。用10mmol/L 磷酸鉀（pH8.0）平衡并灌注濾柱，通過(guò)增加鹽濃度進(jìn)行梯度洗脫。測(cè)量每一組分的吸光值比率（495/280或550/280）。