人P-選擇素（P-selectin）ELISA試劑盒實驗說明書

本試劑僅供研究使用  標(biāo)本：血清或血漿

試驗原理：
人P-選擇素（P-selectin）試劑盒是固相夾心法酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）.已知P-selectin濃度的標(biāo)準(zhǔn)品、未知濃度的樣品加入微孔酶標(biāo)板內(nèi)進行檢測。先將P-selectin和標(biāo)記的抗體同時溫育。洗滌后，加入親和素標(biāo)記過的HRP。再經(jīng)過溫育和洗滌，去除未結(jié)合的酶結(jié)合物，然后加入底物A、B，和酶結(jié)合物同時作用。產(chǎn)生顏色。顏色的深淺和樣品中P-selectin的濃度呈比例關(guān)系。

試劑盒內(nèi)容及其配制
人P-選擇素（P-selectin）試劑盒成份（2-8℃保存） 96孔配置 48孔配置 配制
96/48人份酶標(biāo)板 塊板（96T） 半塊板（48T） 即用型
塑料膜板蓋 塊 半塊 即用型
標(biāo)準(zhǔn)品：400ng/ml 瓶（0.6ml） 瓶（0.3ml） 按說明書進行稀稀
空白對照 瓶（.0ml） 瓶（0.5ml） 即用型
標(biāo)準(zhǔn)品稀釋緩沖液 瓶（5ml） 瓶（2.5ml） 即用型
標(biāo)記的抗P-selectin抗體 瓶（6ml） 瓶（3.0ml） 即用型
親和鏈酶素-HRP 瓶（0ml） 瓶（5.0ml） 即用型
洗滌緩沖液 瓶（20ml） 瓶（0ml） 按說明書進行稀釋
底物A 瓶（6.0ml） 瓶（3.0ml） 即用型
底物B 瓶（6.0ml） 瓶（3.0ml） 即用型
終止液 瓶（6.0ml） 瓶（3.0ml） 即用型

自備材料
． 蒸餾水。
2． 加樣器：5ul、0ul、50ul、00ul、200ul、500ul、000ul。
3． 人P-選擇素（P-selectin）振蕩器及磁力攪拌器等。

安全性
． 避免直接接觸終止液和底物A、B。一旦接觸到這些液體，請盡快用水沖洗。
2． 實驗中不要吃喝、抽煙或使用化妝品。
3． 不要用嘴吸取試劑盒里的任何成份。

操作注意事項
． 試劑應(yīng)按標(biāo)簽說明書儲存，使用前恢復(fù)到室溫。稀稀過后的標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)丟棄，不可保存。
2． 實驗中不用的板條應(yīng)立即放回包裝袋中，密封保存，以免變質(zhì)。
3． 不用的其它試劑應(yīng)包裝好或蓋好。不同批號的試劑不要混用。保質(zhì)前使用。
4． 使用一次性的吸頭以免交叉污染，吸取終止液和底物A、B液時，避免使用帶金屬部分的加樣器。
5． 使用干凈的塑料容器配置洗滌液。使用前充分混勻試劑盒里的各種成份及樣品。
6． 人P-選擇素（P-selectin）洗滌酶標(biāo)板時應(yīng)充分拍干，不要將吸水紙直接放入酶標(biāo)反應(yīng)孔中吸水。
7． 底物A應(yīng)揮發(fā)，避免長時間打開蓋子。底物B對光敏感，避免長時間暴露于光下。避免用手接觸，有毒。實驗完成后應(yīng)立即讀取OD值。
8． 加入試劑的順序應(yīng)一致，以保證所有反應(yīng)板孔溫育的時間一樣。
9． 按照說明書中標(biāo)明的時間、加液的量及順序進行溫育操作。

樣品收集、處理及保存方法
、 血清-----操作過程中避免任何細胞刺激。使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管。收集血液后，000×g離心0分鐘將血清和紅細胞迅速小心地分離。
2、 血漿-----EDTA、檸檬酸鹽、肝素血漿可用于檢測。000×g離心30分鐘去除顆粒。
3、 細胞上清液---000×g離心0分鐘去除顆粒和聚合物。
4、 保存------如果樣品不立即使用，應(yīng)將其分成小部分-70 ℃保存，避免反復(fù)冷凍。盡可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量顆粒，檢測前先離心或過濾。不要在37℃或更高的溫度加熱解凍。應(yīng)在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

試劑的準(zhǔn)備
． 標(biāo)準(zhǔn)品：標(biāo)準(zhǔn)品的系列稀釋應(yīng)在實驗時準(zhǔn)備，不能儲存。稀釋前將標(biāo)準(zhǔn)品振蕩混勻。稀釋比例按下表中進行：
400 ng/ml （6號標(biāo)準(zhǔn)品） 原倍濃度不用稀釋直接加入50ul。
200 ng/ml （5號標(biāo)準(zhǔn)品） 00ul的原倍標(biāo)準(zhǔn)品加入00ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
00 ng/ml （4號標(biāo)準(zhǔn)品） 00ul的5號標(biāo)準(zhǔn)品加入00ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
50 ng/ml （3號標(biāo)準(zhǔn)品） 00ul的4號標(biāo)準(zhǔn)品加入00ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
25 ng/ml （2號標(biāo)準(zhǔn)品） 00ul的3號標(biāo)準(zhǔn)品加入00ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
2.5 ng/ml （號標(biāo)準(zhǔn)品） 00ul的2號標(biāo)準(zhǔn)品加入00ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液
0 ng/ml （空白對照） 原始濃度不用稀釋直接加入50ul。

2． 洗滌緩沖液（50×）的稀釋：蒸餾水50倍稀釋。

操作步驟
． 使用前，將所有試劑充分混勻。不要使液體產(chǎn)生大量的泡沫，以免加樣時加入大量的氣泡，產(chǎn)生加樣上的誤差。
2． 根據(jù)待測樣品數(shù)量加上標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)量決定所需的板條數(shù)。每個標(biāo)準(zhǔn)品和空白孔建議做復(fù)孔。每個樣品根據(jù)自己的數(shù)量來定，能使用復(fù)孔的盡量做復(fù)孔。
3． 人P-選擇素（P-selectin）加入稀釋好后的標(biāo)準(zhǔn)品50ul于反應(yīng)孔、加入待測樣品50ul于反應(yīng)孔內(nèi)。立即加入50ul的標(biāo)記的抗體。蓋上膜板，輕輕振蕩混勻，37℃溫育小時。
4． 甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復(fù)此操作3次。如果用洗板機洗滌，洗滌次數(shù)增加一次。
5． 每孔加入80ul的親和鏈酶素-HRP，輕輕振蕩混勻，37℃溫育30分鐘。
6． 甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復(fù)此操作3次。如果用洗板機洗滌，洗滌次數(shù)增加一次。
7． 每孔加入底物A、B各50ul，輕輕振蕩混勻，37℃溫育0分鐘。避免光照。
8． 取出酶標(biāo)板，迅速加入50ul終止液，加入終止液后應(yīng)立即測定結(jié)果。
9． 在450nm波長處測定各孔的OD值。