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大鼠核轉錄因子(NF-κB)ELISA試劑盒操作原理說明

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大鼠核轉錄因子(NF-κB)ELISA試劑盒操作原理說明

本試劑僅供研究使用  標本:血清或血漿

試驗原理:
大鼠核轉錄因NF-κB試劑盒是固相夾心法酶聯免疫吸附實驗(ELISA).已知NF-κB濃度的標準品、未知濃度的樣品加入微孔酶標板內進行檢測。先將NF-κB和標記的抗體同時溫育。洗滌后,加入親和素標記過的HRP。再經過溫育和洗滌,去除未結合的酶結合物,然后加入底物A、B,和酶結合物同時作用。產生顏色。顏色的深淺和樣品中NF-κB的濃度呈比例關系。

試劑盒內容及其配制
大鼠核轉錄因NF-κB試劑盒成份(2-8℃保存) 96孔配置 48孔配置 配制
96/48人份酶標板 塊板(96T) 半塊板(48T) 即用型
塑料膜板蓋 塊 半塊 即用型
標準品:8.0umol/L 瓶(0.6ml) 瓶(0.3ml) 按說明書進行稀稀
空白對照 瓶(.0ml) 瓶(0.5ml) 即用型
標準品稀釋緩沖液 瓶(5ml) 瓶(2.5ml) 即用型
標記的抗NF-κB抗體 瓶(6ml) 瓶(3.0ml) 即用型
親和鏈酶素-HRP 瓶(0ml) 瓶(5.0ml) 即用型
洗滌緩沖液 瓶(20ml) 瓶(0ml) 按說明書進行稀釋
底物A 瓶(6.0ml) 瓶(3.0ml) 即用型
底物B 瓶(6.0ml) 瓶(3.0ml) 即用型
終止液 瓶(6.0ml) 瓶(3.0ml) 即用型

自備材料
. 蒸餾水。
2. 加樣器:5ul、0ul、50ul、00ul、200、500ul、000ul。
3. 振蕩器及磁力攪拌器等。

安全性
. 大鼠核轉錄因NF-κB避免直接接觸終止液和底物A、B。一旦接觸到這些液體,請盡快用水沖洗。
2. 實驗中不要吃喝、抽煙或使用化妝品。
3. 不要用嘴吸取試劑盒里的任何成份。

操作注意事項
. 試劑應按標簽說明書儲存,使用前恢復到室溫。稀稀過后的標準品應丟棄,不可保存。
2. 實驗中不用的板條應立即放回包裝袋中,密封保存,以免變質。
3. 不用的其它試劑應包裝好或蓋好。不同批號的試劑不要混用。保質前使用。
4. 使用一次性的吸頭以免交叉污染,吸取終止液和底物A、B液時,避免使用帶金屬部分的加樣器。
5. 大鼠核轉錄因NF-κB使用干凈的塑料容器配置洗滌液。使用前充分混勻試劑盒里的各種成份及樣品。
6. 洗滌酶標板時應充分拍干,不要將吸水紙直接放入酶標反應孔中吸水。
7. 底物A應揮發(fā),避免長時間打開蓋子。底物B對光敏感,避免長時間暴露于光下。避免用手接觸,有毒。實驗完成后應立即讀取OD值。
8. 加入試劑的順序應一致,以保證所有反應板孔溫育的時間一樣。
9. 按照說明書中標明的時間、加液的量及順序進行溫育操作。

樣品收集、處理及保存方法
、 血清-----操作過程中避免任何細胞刺激。使用不含熱原和內毒素的試管。收集血液后,000×g離心0分鐘將血清和紅細胞迅速小心地分離。
2、 血漿-----EDTA、檸檬酸鹽、肝素血漿可用于檢測。000×g離心30分鐘去除顆粒。
3、 細胞上清液---000×g離心0分鐘去除顆粒和聚合物。
4、 保存------如果樣品不立即使用,應將其分成小部分-70 ℃保存,避免反復冷凍。盡可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量顆粒,檢測前先離心或過濾。不要在37℃或更高的溫度加熱解凍。應在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

試劑的準備
. 標準品:大鼠核轉錄因NF-κB標準品的系列稀釋應在實驗時準備,不能儲存。稀釋前將標準品振蕩混勻。稀釋比例按下表中進行:
8.0 umol/L (6號標準品) 原倍濃度不用稀釋直接加入50ul。
4.0 umol/L (5號標準品) 00ul的原倍標準品加入00ul的標準品稀釋液
2.0 umol/L (4號標準品) 00ul的5號標準品加入00ul的標準品稀釋液
.0 umol/L (3號標準品) 00ul的4號標準品加入00ul的標準品稀釋液
0.5 umol/L (2號標準品) 00ul的3號標準品加入00ul的標準品稀釋液
0.25 umol/L (號標準品) 00ul的2號標準品加入00ul的標準品稀釋液
0 umol/L (空白對照) 原始濃度不用稀釋直接加入50ul。

2. 洗滌緩沖液(50×)的稀釋:蒸餾水50倍稀釋。

操作步驟
. 大鼠核轉錄因NF-κB使用前,將所有試劑充分混勻。不要使液體產生大量的泡沫,以免加樣時加入大量的氣泡,產生加樣上的誤差。
2. 根據待測樣品數量加上標準品的數量決定所需的板條數。每個標準品和空白孔建議做復孔。每個樣品根據自己的數量來定,能使用復孔的盡量做復孔。
3. 加入稀釋好后的標準品50ul于反應孔、加入待測樣品50ul于反應孔內。立即加入50ul的標記的抗體。蓋上膜板,輕輕振蕩混勻,37℃溫育小時。
4. 甩去孔內液體,每孔加滿洗滌液,振蕩30秒,甩去洗滌液,用吸水紙拍干。重復此操作3次。如果用洗板機洗滌,洗滌次數增加一次。
5. 每孔加入80ul的親和鏈酶素-HRP,輕輕振蕩混勻,37℃溫育30分鐘。
6. 甩去孔內液體,每孔加滿洗滌液,振蕩30秒,甩去洗滌液,用吸水紙拍干。重復此操作3次。如果用洗板機洗滌,洗滌次數增加一次。
7. 每孔加入底物A、B各50ul,輕輕振蕩混勻,37℃溫育0分鐘。避免光照。
8. 取出酶標板,迅速加入50ul終止液,加入終止液后應立即測定結果。
9. 在450nm波長處測定各孔的OD值。

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