DNA末端修飾原理

【資料簡介】

Chapter 4 replication
DNA replication
DNA damage and repair
Reverse transcription
RNA replication
DNA復(fù)制的基本特點(diǎn)
半保留復(fù)制(self-conservative replication)
復(fù)制子(replicon)
半保留復(fù)制
1958年,Meselson 和Stahl用實(shí)驗(yàn)證實(shí)了DNA的半保留復(fù)制.
步驟:
用普通培養(yǎng)基(14N)培養(yǎng)15N標(biāo)記的大腸桿菌.用CsCl密度梯度離心法分析DNA.
加熱子一代DNA分子.
復(fù)制子(replicon)
復(fù)制子:基因組中能單獨(dú)進(jìn)行復(fù)制的單位.
每個(gè)起始點(diǎn)到終止點(diǎn)的區(qū)域?yàn)橐粋€(gè)復(fù)制子.
起始點(diǎn)(origin of replication ,ori):原核生物DNA分子中只有一個(gè),長度 200bp左右.大腸桿菌ori C有245 bp.真核生物有多個(gè)復(fù)制起始點(diǎn).
終點(diǎn)(ter):D,A,C,B(23bp共有序列)Tus(terminator utilization substance)識(shí)別終止序列.
復(fù)制的方向:單向或雙向 
原核生物DNA聚合酶(DNA polymerase,DNA pol)
1958年Kornberg首先從大腸桿菌提取
DNA polⅠ:聚合作用:5` → 3`
3` → 5`外切酶活性:校對(duì)功能
5` → 3`外切酶活性:引物切除,損傷修復(fù)
主要功能是切除引物,填補(bǔ)岡崎片段產(chǎn)生的空隙及DNA損傷的修復(fù)
DNA polⅠ是單一肽鏈的大分子,分子量為109kD,二級(jí)結(jié)構(gòu)以α-螺旋為主.
用特異的蛋白酶處理,可把DNA polⅠ水解為兩個(gè)片段,即在F,G螺旋之間發(fā)生斷裂.
小片段:323個(gè)氨基酸殘基, 5` → 3`外切酶活性
大片段或稱Klenow片段:604個(gè)氨基酸殘基,DNA聚合酶活性和3` → 5`外切酶活性
DNA pol Ⅱ:5` → 3`聚合酶活性及3` → 5`外切核酸酶活性.
DNA polⅢ: 由10 個(gè)亞基組成,分別為α,ε,θ,τ,δ,δ`,β,κ及ψ.是原核生物體內(nèi)真正起復(fù)制作用的酶.
α亞基: 5` → 3`聚合酶活性
ε亞基:3` → 5`外切酶,校對(duì)和編輯
θ為裝配必須
大腸桿菌DNA聚合酶Ⅲ
真核生物DNA聚合酶
α,β,γ及δ四種,都有5`→ 3`聚合功能.α及δ參與核DNA復(fù)制;
α:鏈合成的引發(fā),δ:鏈的延長
polδ;切除引物后填補(bǔ)空隙
β:外切核酸酶 
γ:線粒體DNA復(fù)制
其它環(huán)狀DNA分子的復(fù)制
1,θ復(fù)制:首先由J.Carins 從大腸桿菌中觀察到,又稱為 Carins復(fù)制.
2,滾環(huán)復(fù)制(rolling circle replication)
3,D環(huán)復(fù)制(D loop replication):線粒體DNA復(fù)制
端粒與端粒酶(omerase)
omere:真核生物線性染色體3末端的一種特殊結(jié)構(gòu).核苷酸重復(fù)序列富含G,和端粒結(jié)合蛋白組成核蛋白復(fù)合物.人的DNA端粒含有TTAGGG重復(fù)序列,長度5~15kb.
作用:保護(hù)染色體末端免于化學(xué)修飾或核酸酶降解;解決染色體復(fù)制時(shí)末端丟失問題.

omerase: 由RNA和蛋白質(zhì)組成的酶.兼有模板和逆轉(zhuǎn)錄酶兩方面的作用.
1995年,Junli Feng等克隆了人類端粒酶RNA基因,長約450個(gè)堿基的RNA序列中有一段長11個(gè)核苷酸的區(qū)域(5-CUAACCCUAAC-3)與人的端粒序列(TTAGGG)n互補(bǔ).
端粒酶蛋白質(zhì)的分離:四膜蟲端粒酶兩個(gè)多肽成分p80和p95.
端粒與衰老
實(shí)驗(yàn):在無端粒酶活性的成纖維細(xì)胞中表達(dá)端粒酶時(shí),端粒的縮短和細(xì)胞的衰老都受到抑制.
結(jié)論:細(xì)胞的衰老是由端粒驅(qū)動(dòng)的.
體外培養(yǎng)的細(xì)胞端粒的長度隨細(xì)胞逐代相傳而縮短,丟失到一定程度便失去對(duì)染色體的保護(hù)作用.細(xì)胞隨之發(fā)生衰老和死亡.
可把端?？闯梢幻骁?端粒的長度是鐘上的刻度,記載了細(xì)胞分裂的次數(shù),稱為"端粒鐘",或有絲分裂鐘 或"生命的時(shí)鐘",可通過測(cè)定端粒的長度預(yù)測(cè)細(xì)胞的壽命.
胚胎細(xì)胞和生殖細(xì)胞端粒的長度并不隨細(xì)胞分裂次數(shù)的增加而縮短,具有無限的分裂能力,原因在于端粒酶的存在.