提高PCR的忠實(shí)性

【資料簡(jiǎn)介】

帶有校正功能的酶 

包括克隆和效率分析，PCR產(chǎn)物表達(dá)或定點(diǎn)突變?cè)趦?nèi)的PCR應(yīng)用都需要高忠實(shí)性的PCR。Taq dna聚合酶被看做是低忠實(shí)性的聚合酶，因?yàn)槠淙鄙?’到5’外切核酸酶（校正）活性。

使用帶有3’到5’外切核酸酶活性的熱穩(wěn)定聚合酶可以提高忠實(shí)性。 

但是這些聚合酶的產(chǎn)量比taq DNA聚合酶低。Platinum Pfx DNA聚合酶明顯比Taq DNA聚合酶忠實(shí)性高，而且?guī)в蠵latinum產(chǎn)品產(chǎn)量和特異性高的優(yōu)點(diǎn)（圖25）。 

使用人thrombospondin的1.1kb片段的探針對(duì)基因組DNA（泳道1到6分別為100，50，10，5，1和0ng）擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)。A組，使用1單位Platinum Pfx Taq DNA聚合酶，在室溫配制反應(yīng)液。B組，使用2.5單PfuTurbo™ DNA聚合酶，在冰上配制反應(yīng)液。C組，使用1單位Taq DNA聚合酶，在冰上配制反應(yīng)液。 

酶混合物 

將Taq DNA聚合酶同帶有3’到5’外切核酸酶活性第二種聚合酶混合在一起可以獲得比單獨(dú)Taq DNA聚合酶高的忠實(shí)性，并可以得到高產(chǎn)量及擴(kuò)增長模板。Gibco BRL高保真酶混合物，Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity忠實(shí)性是單獨(dú)Taq DNA聚合酶的6倍，并可以zui高擴(kuò)增到12kb。 

其他參數(shù) 
除了酶，高濃度的dNTP或鎂離子會(huì)降低忠實(shí)性。將dNTP的濃度從200μM降低到25-50μM可以增加度。如果四種核苷的濃度不同，忠實(shí)性會(huì)受影響。進(jìn)行較少的PCR循環(huán)也會(huì)有助于增加忠實(shí)性，因?yàn)樵黾友h(huán)數(shù)目和產(chǎn)物長度就會(huì)增加突變可能性。