*瓊脂糖凝膠使用說(shuō)明

【資料簡(jiǎn)介】

Pgex載體表達(dá)的外源蛋白與*S-轉(zhuǎn)移酶溶合，因此可以通過(guò)*-瓊脂糖親和層析進(jìn)行純化。Pgex是一類(lèi)以*（γ-*半胱胺酰*）作為底物，通過(guò)形成硫醇尿酸失活毒性小分子的酶。由于GST對(duì)底物的親和力是亞豪摩爾級(jí)的，因此*固化瓊脂糖形成的親和層析樹(shù)脂GST及其融合蛋白的純化效率很高。可以用含游離*的緩沖液洗脫結(jié)合GST融合蛋白。樹(shù)脂用3mol/L NaCl的緩沖液再生。
*瓊脂糖對(duì)GST融合蛋白的結(jié)合能力很強(qiáng)（每毫升柱床體積的樹(shù)脂能結(jié)合8毫克融合蛋白）。
*樹(shù)脂的處理
1. 輕輕顛倒盛有*-瓊脂糖樹(shù)脂的容器，將樹(shù)脂混成勻漿
2. 取部分勻漿放入15ml聚丙烯管（每100ml 細(xì)菌培養(yǎng)物需要2ml勻漿）
3. 4℃ 500 g離心5分鐘，小心去掉上清。
4. 在樹(shù)脂中加入10倍柱床體積的冷的PBS，顛倒數(shù)次，混合均勻，4℃ 500 g離心5分鐘，小心去掉上清。
5. 每毫升樹(shù)脂加入1毫升冷的PBS，制成50%勻漿，顛倒數(shù)次，混合均勻，懸液冰上放置待用
制備細(xì)胞抽提物
6. 每100毫升培養(yǎng)基的細(xì)胞沉淀懸于4mlPBS
7. 加入*至終濃度1mg/ml,冰上放置30分鐘
8. 用針筒將10ml 0.2%TritonX-100 強(qiáng)行注入黏的細(xì)胞裂解物中，劇烈振動(dòng)數(shù)次均勻。加入DNase和RNase至終濃度5ug/ml,4℃振動(dòng)溫育10分鐘，4℃3000g離心30分鐘，去除不溶性細(xì)胞碎片，上清轉(zhuǎn)移到一只新管中，加入DTT至終濃度1mmol/L
純化融合蛋白
9. 細(xì)胞裂解物與適量50%*-瓊脂糖樹(shù)脂勻漿混合，每100毫升細(xì)菌培養(yǎng)物加2ml樹(shù)脂，于室溫輕搖30min
10. 混合物于4℃以500g離心5分鐘，小心去掉上清并留樣少許進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳
11. 沉淀中加入10倍柱床體積的冷的PBS，顛倒離心管數(shù)次混勻，洗去未與樹(shù)脂結(jié)合的蛋白。
12. 4℃以500g離心5分鐘，小心去掉上清并留樣少許進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳
13. 重復(fù)步驟11和12兩次
14. 合的GST融合蛋白可用*洗脫緩沖液洗脫，也可用*、腸激酶或Xa因子切割，
用*洗脫融合蛋白
a. 沉淀中加入1倍柱床體積的*洗脫緩沖液，室溫輕輕攪動(dòng)10min,洗脫樹(shù)脂上結(jié)合的蛋白。
b. 如步驟12離心，上清（含洗脫的融合蛋白）移至管中。
c. 重復(fù)步驟a和b，合并三次上清。
蛋白酶解從結(jié)合的GST融合蛋白上揮手靶蛋白
a. 在結(jié)合了融合蛋白的樹(shù)脂中加入*、腸激酶或Xa因子（根據(jù)融合蛋白中的位點(diǎn)選擇），每ml樹(shù)脂加入50單位溶于1mlPBS的蛋白酶。顛倒離心管數(shù)次混勻，室溫下振蕩2-16小時(shí)。用小規(guī)模試驗(yàn)確定時(shí)間。
b. 4℃以500g離心5分鐘，上清小心移至新管中。（GST仍結(jié)合在樹(shù)脂上，而靶蛋白也在上清中，仍需要奮力）
15. 10%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分析每一步樣品的蛋白質(zhì)組成
試劑配制
*洗脫緩沖液：10mmol/L還原型*
50mmol/L Tris-Cl（PH8.0）