細胞培養(yǎng)技術若干問題與注意事項、解決方案

【資料簡介】

細胞培養(yǎng)技術若干問題與注意事項、解決方案
 

一、 細胞培養(yǎng)基礎問答

 

1.BHK細胞就是指BHK21嗎？

 

答：BHK細胞是指幼年敘利亞地鼠腎細胞（Baby Hamster Syrian Kidney），1961年建株。原始的細胞株是成纖維細胞，貼壁依賴性。1963年獲得單細胞克隆細胞。后經無數(shù)次傳代后細胞可懸浮生長，它廣泛用于增殖各種病毒，生產獸用疫苗。 zui常用的是BHK21的一個亞克隆細胞，即克隆13或C13 。

2.二倍體細胞有什么特點？

 

答：二倍體細胞的染色體組型是2n核型；貼壁依賴接觸抑制；一般可傳代50代；無致瘤性。如W1-38：正常胚肺組織*系。MRC-5：從正常男性肺組織中獲得的*系

。

3.什么是動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)？

 

答：所謂動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)技術（large-scale culture technology）是指在人工條件下（設定pH、溫度、溶氧等），在細胞生物反應器（bioreactor）中高密度大量培養(yǎng)動物細胞用于生產生物制品的技術。目前可大規(guī)模培養(yǎng)的動物細胞有雞胚、豬腎、猴腎、地鼠腎等多種原代細胞及*、CHO（中華倉鼠卵巢）細胞、BHK-21、Vero細胞（非洲綠猴腎傳代細胞）等，并已成功生產了包括狂犬病疫苗、口蹄疫疫苗、甲型肝炎疫苗、乙型肝炎疫苗、紅細胞生成素、單克隆抗體等產品。

在過去幾十年來，細胞培養(yǎng)技術經有了很大發(fā)展，從使用轉瓶（roller bottle） 、CellCube等貼壁細胞培養(yǎng)，發(fā)展為生物反應器（Bioreactor）進行大規(guī)模細胞培養(yǎng)。

 

4.細胞體內外培養(yǎng)的差別是什么？

 

答：細胞離體后，失去了神經體液的調節(jié)和細胞間的相互影響，生活在缺乏動態(tài)平衡相對穩(wěn)定環(huán)境中，日久天長，易發(fā)生如下變化：分化現(xiàn)象減弱；形態(tài)功能趨于單一化或生存一定時間后衰退死亡；或發(fā)生轉化獲得不死性，變成可無限生長的連續(xù)細胞系或惡性細胞系。因此，培養(yǎng)中的細胞可視為一種在特定的條件下的細胞群體，它們既保持著與體內細胞相同的基本結構和功能，也有一些不同于體內細胞的性狀。實際上從細胞一旦被置于體外培養(yǎng)后，這種差異就開始發(fā)生了。

 

5.什么是無血清培養(yǎng)基？與普通培養(yǎng)基有什么區(qū)別？

 

答：無血清培養(yǎng)基（serum free medium,SFM）:是不需要添加血清就可以維持細胞在體外較長時間生長繁殖的合成培養(yǎng)基。但是它們可能包含個別蛋白或大量蛋白組分?；境煞譃榛A培養(yǎng)基及添加組分兩大部分。添加組分可能包括纖連蛋白、層粘連蛋白等貼壁因子、胰島素、轉鐵蛋白、硒等。

 

6.什么是無血清無動物組分培養(yǎng)基、無蛋白培養(yǎng)基和限定化學成分培養(yǎng)基？

 

答：無血清無動物組分培養(yǎng)基是不含任何動物來源成份的無血清培養(yǎng)基，但可能添加植物蛋白或重組蛋白。無蛋白培養(yǎng)基（protein free midium,PFM）:即不含有蛋白的培養(yǎng)基，無論是植物蛋白或動物蛋白。成分培養(yǎng)基（chemical defined medium,CDM）:是指培養(yǎng)基中的素有成分都是明確的，它同樣不含有蛋白，也不是添加了植物水解物，而是使用了一些已知結構與功能的小分子化合物，如短肽等。這種培養(yǎng)基更有利于分析細胞的分泌產物和產品純化。

7.HEPES在細胞培養(yǎng)過程中起什么作用？

 

答：HEPES溶液：是一種弱酸，中文名字是羥乙基哌秦乙硫磺酸，主要作用是防止培養(yǎng)基pH迅速變動。在開放式培養(yǎng)條件下，觀察細胞時培養(yǎng)基脫離了5%CO2的環(huán)境，CO2氣體迅速逸出，pH迅速升高，若加了HEPES，此時可以維持pH7.0左右。一般在進行克隆化培養(yǎng)時要添加HEPES。

 

8.CO2 培養(yǎng)箱之水盤如何保持清潔？

 

答：定期（至少每兩周一次） 以無菌蒸餾水或無菌去離子水更換之。

 

二、 培養(yǎng)基生產和使用常見問題

 

1. 低血清培養(yǎng)基能用肉眼判斷其pH值嗎？

 

答：低血清培養(yǎng)基中酚紅的含量與普通培養(yǎng)基中的酚紅含量不同，不能通過肉眼觀察或通過經驗來判定pH值，建議使用pH計進行測定。

 

2.低血清培養(yǎng)基的緩沖系統(tǒng)是什么？

 

答：平衡鹽一般是由無機鹽及葡萄糖組成的。平衡鹽有Hanks′系統(tǒng)、Earle′s系統(tǒng)、Dulbecco′s磷酸緩沖鹽系統(tǒng)等。199系列培養(yǎng)基、MEM系列培養(yǎng)基均有Hanks′系統(tǒng)的培養(yǎng)基及Earle′s系統(tǒng)的培養(yǎng)基。但是有些培養(yǎng)基均不是以上常規(guī)的平衡鹽系統(tǒng)，例如RPMI 1640培養(yǎng)基、F12培養(yǎng)基。MEM（SLM）低血清培養(yǎng)基的平衡鹽系統(tǒng)也不是常規(guī)的平衡鹽系統(tǒng)，該平衡鹽系統(tǒng)的緩沖能力強于常規(guī)平衡鹽系統(tǒng)的緩沖能力。

 

3.*溶液和*的配制方法是什么？

 

答：以0.2mol/L的 L-*配制為例：稱取L-*2.92g，加注射用水100ml，充分攪拌混勻。用0.2μm濾膜正壓過濾除菌。溶液應在4℃下避光保存，2周內使用。 以7.5% NaHCO3的配制為例：稱取NaHCO37.5g溶于100ml蒸餾水中過濾除菌。

 

4.什么培養(yǎng)基中可以省去加酚紅？

 

答：酚紅在培養(yǎng)基中用作pH值的指示劑：中性時為紅色，酸性時為黃色，堿性時為紫色。酚紅本身對生物制品質量并不會產生影響，可以通過純化技術去除，但酚紅在無血清培養(yǎng)基可能帶來胞內鈉/鉀失衡，影響細胞生長，當然這種作用能被血清所中和或減輕。 酚紅并不是培養(yǎng)基中必需的一種成分，很多國外的疫苗或抗體生產企業(yè)在生產過程中都使用無酚紅培養(yǎng)基。