大鼠信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子7（Smad7）ELISA試劑盒實驗原理

【資料簡介】

大鼠信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子7（Smad7）ELISA試劑盒實驗原理
本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心酶標(biāo)免疫分析法測定標(biāo)本中Smad7水平。用純化的抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入Smad7抗原、化的抗大鼠Smad7抗體、HRP標(biāo)記的親和素，經(jīng)過*洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的Smad7呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計算樣品濃度。 
試劑盒組成及試劑配制 
酶聯(lián)板：一塊（96孔） 
標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）：2瓶，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至ml，蓋好后靜置0分鐘以上，然后反復(fù)顛倒/搓動以助溶解，其濃度為2000 pg/mL，做系列倍比稀釋后，分別稀釋成2000 pg/mL，6000 pg/mL ，300 pg/mL，500 pg/mL，750 pg/mL，375 pg/mL，87 pg/mL，其原液直接作為zui高標(biāo)準(zhǔn)濃度，樣品稀釋液直接作為標(biāo)準(zhǔn)濃度0 pg/mL，臨用前5分鐘內(nèi)配制。
如配制5000 pg/mL標(biāo)準(zhǔn)品：取0.5ml 0000 pg/mL的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。
樣品稀釋液：×20ml/瓶。
檢測稀釋液A：×0ml/瓶。
檢測稀釋液B：×0ml/瓶。
檢測溶液A：×20ul/瓶（：00）臨用前以檢測稀釋液A ：00稀釋，稀釋前根據(jù)預(yù)先計算好的每次實驗所需的總量配制（每孔00ul），實際配制時應(yīng)多配制0.-0.2ml。如ul檢測溶液A加99ul檢測稀釋液A的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時內(nèi)配制。
檢測溶液B：×20ul/瓶（：00）臨用前以檢測稀釋液B：00稀釋。稀釋方法同檢測溶液A。
底物溶液：×0ml/瓶。 
濃洗滌液：×30ml/瓶，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍。 
終止液：×0ml/瓶（2N H2SO4）。 
標(biāo)本的采集及保存 
．細(xì)胞培養(yǎng)物上清：請離心后收集上清，并將標(biāo)本保存于-20℃，且應(yīng)避免反復(fù)凍融。
2．血清：標(biāo)本請于室溫放置2小時或4℃過夜后于000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測，或?qū)?biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
3．血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8° C 000 x g離心5分鐘，或?qū)?biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
注：標(biāo)本溶血會影響zui后檢測結(jié)果，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項檢測。
大鼠信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子7（Smad7）ELISA試劑盒操作步驟
各試劑在使用前平衡至室溫。實驗開始前，請?zhí)崆芭渲煤盟性噭?，試劑或樣品稀釋時，均需混勻，混勻時盡量避免起泡。每次檢測都應(yīng)該做標(biāo)準(zhǔn)曲線。如樣品濃度過高時，應(yīng)在試管中將樣品用樣品稀釋液進(jìn)行稀釋，以使樣品符合試劑盒的檢測范圍。
加樣：分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔。空白孔加樣品稀釋液00ul，余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品00ul，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜，37℃反應(yīng)20分鐘。
為保證實驗結(jié)果有效性，每次實驗請使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。
棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加檢測溶液A工作液 00ul（取ul檢測溶液A加99ul檢測稀釋液A的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時內(nèi)配制），37℃,60分鐘。
溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板3次，每次浸泡-2分鐘，350ul/每孔，甩干（也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干）。 
每孔加檢測溶液B工作液（同檢測A工作液） 00ul，37℃，60分鐘。
溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次，每次浸泡-2分鐘，350ul/每孔，甩干（也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干）。
依序每孔加底物溶液90ul，37℃避光顯色（30分鐘內(nèi)）（此時肉眼可見標(biāo)準(zhǔn)品的前3-4孔有明顯的梯度蘭色，后3-4孔梯度不明顯）。
依序每孔加終止溶液50ul，終止反應(yīng)（此時藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性，底物反應(yīng)時間到后應(yīng)盡快加入終止液。
用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）。 在加終止液后5分鐘以內(nèi)進(jìn)行檢測。

注：
． 每次實驗留一孔作為空白調(diào)零孔，該孔不加任何試劑，只是zui后加底物溶液及2NH2SO4。測量時先用此孔調(diào)OD值至零。 
2．為防止樣品蒸發(fā)，試驗時將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi)，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜。
3. 未使用完的酶標(biāo)板或者試劑，請于2-8℃保存。標(biāo)準(zhǔn)品、檢測溶液A工作液、檢測溶液B工作液請依據(jù)所需的量配置使用，不要一次用完。請勿重復(fù)使用已稀釋過的標(biāo)準(zhǔn)品、檢測溶液A工作液或檢測溶液B工作液。
4. 建議檢測樣品時均設(shè)雙孔測定，以保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體；在實驗臺上鋪墊幾層吸水
紙，酶標(biāo)板朝下用力拍幾次；將的洗滌緩沖液至少0.3ml注入孔內(nèi)，浸泡-2分鐘，根據(jù)需
要，重復(fù)此過程數(shù)次。
自動洗板：如果有自動洗板機(jī)，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實驗過程中。

特異性
本試劑盒可同時檢測重組或天然的大鼠Smad7，且與其它相關(guān)蛋白無交叉反應(yīng)。
計算
以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)（對數(shù)坐標(biāo)），OD值為縱坐標(biāo)（普通坐標(biāo)），在半對數(shù)坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。 
大鼠信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子7（Smad7）ELISA試劑盒注意事項
洗滌過程非常重要，不充分的洗滌易造成假陽性。
一次加樣時間控制在5分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多，使用排槍加樣。
請每次測定的同時做標(biāo)準(zhǔn)曲線，做復(fù)孔。
如標(biāo)本中待測物質(zhì)含量過高，請先稀釋后再測定，計算時請zui后乘以稀釋倍數(shù)。
5．在配制標(biāo)準(zhǔn)品、檢測溶液工作液時，請以相應(yīng)的稀釋液配制，不能混淆。
6．底物請避光保存。