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動物外周血淋巴細胞分離液實驗方法
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關(guān) 鍵 詞 | 動物外周血淋巴細胞分離液實驗方法 |
- 【資料簡介】
“XXXX”動物外周血淋巴細胞分離液實驗方法
技術(shù)文檔編號:TBD0017SOP
【產(chǎn)品規(guī)格】
200ml/Kit
【產(chǎn)品組成】
為方便廣大用戶使用,試劑內(nèi)容如下:
名稱
產(chǎn)品編號
規(guī)格
A
XXXX 動物外周血淋巴細胞分離液
200ml
B
樣本稀釋液(贈品)
2010C1119
200ml
C
清洗液(贈品)
2010X1118
200ml
D
說明書
1 份
【實驗前準(zhǔn)備】
1. 適用儀器
最大離心力可達 1200g 的水平轉(zhuǎn)子離心機
2. 抗凝劑的選擇
在動物實驗采血時,很多實驗者選擇醫(yī)用真空獲得抗凝血,醫(yī)用中的抗凝 劑只考慮血漿質(zhì)量,但不利于高純度細胞分離實驗。
為此,別開發(fā)出抗凝劑及抗凝管專用于細胞分離,改變使用普通 獲得抗凝血分離效果不佳,提取率及純度低下的不良結(jié)果。3. PBMC 高效離心管(詳見 PBMC 高效離心管使用說明)
序號
產(chǎn)品名稱
產(chǎn)品貨號
規(guī)格
1
PBMC 高效離心管
601001
50ml
2
PBMC 高效離心管(隨試劑盒附贈 5 支)
601002
15ml
【檢驗方法】
全過程樣本、試劑及實驗環(huán)境均需在 20±2℃的條件下進行。
首先取抗凝血按體積比 1:1 的比例與樣本稀釋液(產(chǎn)品編號:2010C1119)混勻,根據(jù)稀釋后的樣本量大小,分以下兩種情況:
情況 A:稀釋后的血液樣本量小于 5ml 時,實驗方法如下:
1. 取一支 15ml 離心管,先加入與稀釋后樣本等量的分離液(注:分離液最少不得少于 3ml)。
2. 用吸管小心吸取稀釋后的血液樣本加于分離液液面上,400-500g,離心 20-30min(注: 根據(jù)血液樣本量確定離心條件,血液樣本量越多,離心力越大,離心時間越長,具體離 心條件需客戶自行摸索,以達到分離效果)。
3. 離心后,此時離心管中由上至下分為四層。層為血漿層。第二層為環(huán)狀乳白色淋巴 細胞層。第三層為透明分離液層。第四層為紅細胞層。
4. 用吸管小心吸取第二層環(huán)狀乳白色淋巴細胞層到另一 15ml 離心管中,往所得離心管中加入 10ml 清洗液(產(chǎn)品編號:2010X1118),混勻細胞。
5. 250g,離心 10min。
6. 棄上清。
7. 用吸管以 5ml 清洗液(產(chǎn)品編號:2010X1118)重懸所得細胞。
8. 250g,離心 10min。
9. 重復(fù) 6、7、8,棄上清后以 0.5ml 后續(xù)實驗所需相應(yīng)液體重懸細胞。
情況 B:稀釋后的血液樣本量大于等于 5ml 時,實驗方法如下:
1. 取一支適當(dāng)?shù)碾x心管,先加入與稀釋后樣本等量的分離液。
2. 將經(jīng)稀釋后的血液樣本小心加于分離液之液面上,550-650g(最大離心力可至 1000g), 離心 20-30min。(注:根據(jù)血液樣本量確定離心條件,血液量越多,離心力越大,離心時間越長,具體離心條件需客戶自行摸索,以達到分離效果。加入血液樣本后,樣 本及分離液總體積不得超過離心管總體積的三分之二)。
3. 剩余步驟同“情況 A”中步驟 3 至步驟 9。分離圖例
【注意事項】
1. 全過程樣本、試劑及實驗環(huán)境均需在 20±2℃的條件下進行。為獲得的實驗結(jié)果,最好在取血 2h 內(nèi)進行實驗,血液存放時間越長,細胞分離效果越差。血液放置超過 6h 后分離效果更差甚至不能達到分離目的。
2. 本實驗不要使用高聚合材質(zhì)(如聚苯乙烯)的塑料制品,應(yīng)使用無靜電、低靜電離 心管及未經(jīng)堿處理過后的玻璃制品,因為靜電作用將導(dǎo)致細胞貼壁、堿處理的玻璃表面 會變成毛面,影響細胞分離效果。
3. 吸取過多的淋巴細胞層及分離液層會導(dǎo)致分離液交界處的粒細胞被吸出從而使混雜的粒 細胞數(shù)量增加。
4. 吸取過多的淋巴細胞層上層溶液會導(dǎo)致血漿蛋白及血小板混雜。
【儲存條件及有效期】
常溫保存,有效期 2 年。本品易感染細菌,需無菌條件操作。無菌條件下操作,啟封后置常溫保存。如 4℃保存,本分離液易出現(xiàn)白色結(jié)晶,影響分離效果。
【參考值(參考范圍)】
本實驗淋巴細胞提取率及純度均大于 80%。
下表為成年人外周血中各種細胞的數(shù)量及比例,用戶可適當(dāng)進行參考。
紅細胞
白細胞
血小板
含量(個/L)
(4.0-5.5)×1012
(4.0-10.0)×109
(1.0-3.0)×1011
中性粒細胞
淋巴細胞
單核細胞
50%-70%
20%-40%
3%-8%
【相關(guān)實驗技術(shù)方案】
1. 所獲得淋巴細胞的培養(yǎng)技術(shù)。
2. 所獲得淋巴細胞的核酸提取技術(shù)。
3. 所獲得淋巴細胞的鑒定方法
A. 流式細胞技術(shù)
B. 免疫組化技術(shù)
C. 原位雜交技術(shù)
D. PCR 技術(shù)
【可能存在的問題及解決方法】
1. 由于血液粘度、細胞密度等差異可能造成的問題及解決方案如下表所示:
出現(xiàn)情況
出現(xiàn)原因
建議解決方案
離心后目的細胞存在于血漿層或稀釋液層
轉(zhuǎn)速過小或離心時間過短
適當(dāng)增減轉(zhuǎn)速
離心后目的細胞存在于分離液中
轉(zhuǎn)速過大或離心時間過長
離心后白環(huán)層彌散
細胞密度過大
調(diào)整細胞密度
離心后白環(huán)層太淺或看不見
細胞密度過小
2. 本分離液分離細胞的原理為密度梯度離心,其密度與溫度、大氣壓等密切相關(guān)。不同地 區(qū)客戶可根據(jù)當(dāng)?shù)厍闆r對離心條件進行適當(dāng)調(diào)整。建議對離心條件進行調(diào)整時,恒定離 心時間,對離心轉(zhuǎn)速進行調(diào)整。
3. 本分離液依照國際標(biāo)準(zhǔn),全部使用藥用級原料,性能指標(biāo)與國產(chǎn)同類產(chǎn)品略有不同,可 能出現(xiàn)紅細胞沉降不*的情況,可以適當(dāng)加大離心轉(zhuǎn)速。
注:在對離心條件進行調(diào)整時,離心轉(zhuǎn)速的加減以 50-100g 為基數(shù),直至達到分離效果, 離心力最小不得小于 400g,最大不得大于 1200g。離心時間以 20-30min 為準(zhǔn)。
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