人C型鈉尿肽（CNP）酶聯(lián)免疫詳細(xì)說明

【資料簡介】

　　操作步驟：
　　
　　用于檢測未知抗體的間接法：
　　
　　用包被緩沖液將已知抗原稀釋至1～10μg／ml，每孔加0.1ml，4℃過夜。次日洗滌3次。
　　
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　　加一定稀釋的待檢樣品（未知抗體）0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔中,置37℃孵育1小時,洗滌。（同時做空白、陰性及陽性孔對照）
　　
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　　于反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)第二抗體（抗抗體）0.1ml，37℃孵育30-60分鐘，洗滌,zui后一遍用DDW洗滌。
　　
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　　加底物液顯色：于各反應(yīng)孔中加入臨時配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分鐘。
　　
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　　終止反應(yīng)：于各反應(yīng)孔中加入2M硫酸0.05ml。
　　
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　　結(jié)果判定：可于白色背景上，直接用肉眼觀察結(jié)果：反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深，陽性程度越強(qiáng)，陰性反應(yīng)為無色或極淺，依據(jù)所呈顏色的深淺，以“+”、“-”號表示。也可測OD值：在ELISA檢測儀上，于450nm（若以ABTS顯色，則410nm）處，以空白對照孔調(diào)零后測各孔OD值，若大于規(guī)定的陰性對照OD值的2.1倍，即為陽性。
　　
　　試劑：
　　
　?。?）包被緩沖液（PH9.60.05M碳酸鹽緩沖液）:
　　
　　NaHCO３1.59克
　　
　　NaHCO３2.93克
　　
　　加蒸餾水至1000ml
　　
　?。?）洗滌緩沖液（PH7.4PBS）：0.15M
　　
　　KH2PO40.2克
　　
　　Na2HPO４·12H2O2.9克
　　
　　NaCl8.0克KCl0.2克
　　
　　Tween-200.05％0.5ml
　　
　　加蒸餾水至1000ml
　　
　?。?）稀釋液：
　　
　　牛血清白蛋白（BSA）0.1克
　　
　　加洗滌緩沖液至100ml
　　
　　或以羊血清、兔血清等血清與洗滌液配成5～10％使用。
　　
　?。?）終止液（2MH２SO４）：
　　
　　蒸餾水178.3ml，逐滴加入濃硫酸（98％）21.7ml。
　　
　　（5）底物緩沖液（PH5.0磷酸棗檸檬酸）:
　　
　　0.2MNa２HPO４（28.4克／L）25.7ml
　　
　　0.1M檸檬酸（19.2克／L）24.3ml
　　
　　加蒸餾水50ml。
　　
　?。?）TMB（四甲基聯(lián)苯胺）使用液:
　　
　　TMB（10mg／5ml無水乙醇）0.5ml
　　
　　底物緩沖液（PH5.5）10ml
　　
　　0.75％H２O２32μl
　　
　　（7）ABTS使用液:
　　
　　ABTS0.5mg
　　
　　底物緩沖液（PH5.5）1ml
　　
　　3％H２O２2μl
　　
　?。?）抗原、抗體和酶標(biāo)記抗體。
　　
　?。?）正常人血清和陽性對照血清。
　　
　　器材:
　　
　?。?）聚苯乙烯塑料板（簡稱酶標(biāo)板）40孔或96孔，ELISA檢測儀，50μl及100μl加樣器，塑料滴頭，小毛巾，洗滌瓶。
　　
　　（2）小燒杯、玻璃棒、試管、吸管和量筒等。
　　
　?。?）4℃冰箱，37℃孵育箱。

Elisa試劑盒實(shí)驗(yàn)規(guī)則：
1、要保證移液槍的準(zhǔn)確性，誤差不能超過2%。可用水和電子天平進(jìn)行確定。但有專業(yè)人員進(jìn)行矯正。
2、要配備20ul、50ul、100ul、1000ul和排槍各一支。吸取不同的液體后，要更換槍頭。即使是吸取標(biāo)準(zhǔn)品時。
3、要在實(shí)驗(yàn)前1小時將試劑盒從冰箱中取出，使各種試劑都恢復(fù)到室溫，以使結(jié)果更穩(wěn)定。
4、實(shí)驗(yàn)時，要使底物避光保存。
5、用槍吸取液體時速度不能太快，以免產(chǎn)生氣泡而使吸取量不準(zhǔn)確。
6、吸取液體時，要用量程和需要量接近的槍去吸，減少誤差。
7、將液體加到酶標(biāo)孔中時，避免槍頭和孔內(nèi)液體接觸，可使槍頭上的液滴和孔壁接觸，液滴會自然流下去。
8、液體全部加完后，可將酶標(biāo)板在桌子上平行輕輕晃動30秒，混勻液體。也可以用酶標(biāo)儀的晃動功能。
9、應(yīng)盡量做雙孔實(shí)驗(yàn)，這樣才能保證數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。
10、對結(jié)果有疑問的樣品要用其它方法進(jìn)行確證。