條件性基因敲除小鼠模型實(shí)驗(yàn)技巧

【資料簡(jiǎn)介】

小鼠和大鼠可謂是生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)室里的明星，成功的小鼠和大鼠模型可謂是“生命科學(xué)的好幫手”。很多人可能想自己設(shè)計(jì)或是了解條件性基因敲除小鼠，在此做個(gè)小結(jié)，供大家參考。

條件性基因敲除小鼠的設(shè)計(jì)利用了Cre/LoxP或Flipe/Frt原理。它們都是位點(diǎn)特異性重組酶系統(tǒng)。這里以Cre/LoxP系統(tǒng)為例。比如在待敲除的一段目標(biāo)DNA序列的兩端各放置一個(gè)loxP序列，得到flox（flanked by loxP）小鼠。將flox小鼠與帶有細(xì)胞特異性表達(dá)Cre的小鼠交配繁殖，以獲得在特定細(xì)胞里把目標(biāo)基因敲除掉的小鼠，即條件性基因敲除小鼠。此外，若與控制Cre表達(dá)的其他誘導(dǎo)系統(tǒng)（比如CreERT2）相結(jié)合，還可以對(duì)某一基因同時(shí)實(shí)現(xiàn)時(shí)空兩方面的調(diào)控。

Cre/loxP系統(tǒng)來(lái)源于噬菌體，可以介導(dǎo)位點(diǎn)特異的DNA重組。該系統(tǒng)含有兩個(gè)組成成分：一個(gè)是一段長(zhǎng)34bp的DNA序列（LoxP序列），含有兩個(gè)13 bp的反向重復(fù)序列和一個(gè)8 bp的核心序列。 LoxP的方向由中間這8個(gè)堿基決定。這段LoxP序列是Cre重組酶識(shí)別的位點(diǎn)。 令一個(gè)組成部分是Cre重組酶。它是由噬菌體編碼的一種由343個(gè)氨基酸組成的蛋白。Cre可以介導(dǎo)兩個(gè)LoxP位點(diǎn)的重組，從而引起兩個(gè)LoxP之間DNA序列的缺失。如果將Cre重組酶cDNA通過(guò)基因工程的手段置于組織或細(xì)胞特異性啟動(dòng)子之下，可以得到Cre組織/細(xì)胞特異性表達(dá)的Cre小鼠，也叫Cre工具小鼠。 跟Flox小鼠交配之后，可以得到條件性基因敲除小鼠。

所謂Flox小鼠是指在某個(gè)基因的某個(gè)外顯子兩側(cè)各放一個(gè)LoxP序列。這段序列就是Flanked by LoxP，也就叫做Flox小鼠。這種Flox小鼠一般要通過(guò)設(shè)計(jì)構(gòu)建打靶載體、胚胎干細(xì)胞重組、囊胚顯微注射、和嵌合體小鼠傳代來(lái)獲得。這種小鼠跟Cre工具小鼠交配，由于Cre的表達(dá)，介導(dǎo)兩個(gè)LoxP位點(diǎn)序列的重組，從而敲除兩個(gè)LoxP之間的序列。由于不同Cre工具小鼠的Cre表達(dá)有組織/細(xì)胞特異性，就可以達(dá)到在不同組織、細(xì)胞里特異性敲除目的基因的目標(biāo)。比如上皮細(xì)胞、胸腺細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞、心肌細(xì)胞、腸道、肺臟等。

那如何設(shè)計(jì)條件性基因敲除小鼠呢?這里所說(shuō)的設(shè)計(jì)主要是Flox小鼠的設(shè)計(jì)。所謂條件性敲除，是說(shuō)除了特定細(xì)胞外，其它細(xì)胞里面沒有任何的基因表達(dá)異常。一般情況下，不要在*個(gè)外顯子前面放置LoxP序列。因?yàn)?個(gè)外顯子前面一般是啟動(dòng)子。放置LoxP序列有可能會(huì)破壞或改變啟動(dòng)子活性。條件性敲除一般是敲掉zui早引起移碼突變的外顯子。這樣的話，不要敲除有起始密碼子ATG的外顯子。否則的話，基因可能會(huì)利用ORF內(nèi)的ATG編碼一個(gè)缺少部分N端序列的蛋白，這個(gè)蛋白很可能有全部或部分野生蛋白的功能。在選擇要敲除的外顯子的時(shí)候（各放一個(gè)LoxP在一個(gè)外顯子的兩側(cè)），該外顯子的堿基數(shù)目不能是3N，否則新基因pre-RNA拼接得到的mRNA不能產(chǎn)生移碼突變。會(huì)產(chǎn)生一個(gè)與野生蛋白相比少了一段中間序列的新蛋白。如果一個(gè)外顯子的堿基數(shù)目是3N+1或3N+2，敲除這個(gè)外顯子之后會(huì)產(chǎn)生移碼突變，就可以達(dá)到基因敲除的目的。篩選要敲除（Floxed）的外顯子的時(shí)候，一般是從zui上游的外顯子開始篩選適合敲除的外顯子。需要注意的是，一般的DNA分析軟件不能確定內(nèi)含子和外顯子的邊界，需要仔細(xì)核對(duì)。95%以上的邊界遵循gt/ag邊界原則。也可以在Ensembl上查一個(gè)基因的外顯子和內(nèi)含子。這個(gè)上的結(jié)果絕大部分是正確的。但也需要仔細(xì)核對(duì)。畢竟基因敲除小鼠研發(fā)是一個(gè)時(shí)間比較長(zhǎng)的過(guò)程，需要特別小心。前期做多少的考慮都不嫌多。這些原則只是對(duì)一般課題的考慮。特殊情況需要特殊處理。比如，如果只是想敲除一個(gè)基因的某個(gè)特定domain，或是如果一個(gè)基因有一個(gè)很大的外顯子，這個(gè)時(shí)候即使這個(gè)外顯子的堿基數(shù)目是3N，也可以對(duì)其進(jìn)行敲除。