酶聯(lián)免疫試劑盒的洗板方法

【資料簡介】

　在酶聯(lián)免疫試劑盒試驗中，洗板是非常重要的過程。酶聯(lián)免疫試驗（ELISA）洗滌過程雖不是一個反應(yīng)過程，但卻也決定著實驗的成敗。
　ELISA就是通過洗滌來達(dá)到分離游離和結(jié)合的酶標(biāo)記物的目的，通過洗滌以清除殘留在微孔板中未能與固相抗原或抗體相結(jié)合的物質(zhì)，以及在反應(yīng)過程中的非特異性吸附于固相載體上的干擾物質(zhì)。聚苯乙烯對蛋白質(zhì)的吸附是普遍的，在ELISA測定的反應(yīng)過程中應(yīng)盡量避免非特異性吸附，洗滌時又應(yīng)將這些非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌掉。在ELISA操作中，洗滌是非常關(guān)鍵的，應(yīng)引起操作者的高度重視?！∥覀儗?53例用ELISA方法檢測乙型肝炎表面抗原（HBsAg）的洗板過程進(jìn)行了檢測，采用我們自創(chuàng)的人工洗板法和全自動洗板機洗板對比試驗，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。
1  材料和方法
1.1  材料
1.1.1  標(biāo)本來源及類型  753例標(biāo)本來源于廣東省深圳市龍崗區(qū)南嶺人民醫(yī)院2005年12月8日至2006年1月4日的工廠體檢血清標(biāo)本，其中男性121例，女性653例，年齡17歲～43歲,平均年齡為30歲。
1.1.2  乙型肝炎病毒表面抗原診斷試劑盒（酶聯(lián)免疫法）由上海信然生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。
1.1.3  一個大的臉盆和一些棉質(zhì)毛巾。
1.1.4  消毒劑  健之素（含有效氯500 mg/片）。
1.1.5  特建一個有開關(guān)口的洗滌池。
1.1.6  全自動洗板機  美國MultiwashⅡ。
　1.2  方法
1.2.1  手工法  按試劑說明書嚴(yán)格操作，稀釋液用蒸餾水按1∶20稀釋濃縮洗液，適量置于臉盆之中。從37 ℃水浴溫箱中拿出溫浴到時的反應(yīng)板，到洗滌池處，放開自來水約1 min，然后快速甩掉反應(yīng)液，即用自來水沖洗數(shù)次，甩掉水并用干凈的毛巾吸干，放入配好洗滌液的臉盆之中，浸泡5 min～10 min，然后將反應(yīng)板取出，甩掉洗滌液，再用自來水沖洗數(shù)次，用干凈吸水的毛巾拍干（多次）反應(yīng)板。加顯色劑A、B后，振蕩封板，放入37 ℃水浴溫箱10 min，取出，加終止液，振蕩，上酶標(biāo)儀讀板，觀察結(jié)果。按感染性醫(yī)療廢物處理洗滌池的液體及用過的洗滌液：加入健之素（500 mg/片），使其濃度達(dá)到2 500 mg/L，浸泡24 h，收集起來，交醫(yī)療廢物處理公司處理。
1.2.2  洗板機法  按試劑說明書嚴(yán)格操作，稀釋液用蒸餾水按1∶20稀釋濃縮洗液，適量置于洗板機洗液瓶里。將反應(yīng)到時的反應(yīng)板取出，用洗板機洗板5次，每次浸泡1 min，取出，用干凈的毛巾拍干（多次）反應(yīng)板。加顯色劑A、B后，振蕩封板，放入37 ℃水浴溫箱10 min，取出，加終止液，振蕩，上酶標(biāo)儀讀板，觀察結(jié)果。
1.2.3  假陽性排除  實際工作中，我們發(fā)現(xiàn)假陽性一般顯色都較淡，即弱陽性；為了排除假陽性，將753例中18例弱陽性（酶標(biāo)儀讀數(shù)0.1050.05，兩種洗板方法差異無顯著性，結(jié)果見表1。
表1  753例HBsAg（手工法和洗板機法洗板）檢測結(jié)果（略）
注：組間比較，χ2=0.01，P>0.05。
2.2  18例弱陽性標(biāo)本的檢測  用兩種方法洗板，結(jié)果陽性15例，陰性3例為假陽性；弱陽性率占753例樣本的2.39%（18/753），假陽性占0.39%（3/753）。
2.3  3例弱陽性標(biāo)本  經(jīng)重新處理標(biāo)本，重新檢驗，用兩種方法進(jìn)行洗板檢測，結(jié)果3例都為陰性，而未出現(xiàn)1例陽性，確定3例為假陽性，應(yīng)排除。
　3  討論
根據(jù)酶聯(lián)免疫試劑盒檢測原理可知洗滌是為了去除未結(jié)合的多余的酶標(biāo)物質(zhì)，但又不能把結(jié)合的酶標(biāo)物質(zhì)洗脫，它即簡單又重要，即可用手工法也可用機械法。筆者用ELISA法檢測了753例體檢血清標(biāo)本的HBsAg，分別用我們自創(chuàng)的手工法洗板和全自動洗板機法洗板，進(jìn)行組間比較，P>0.05，結(jié)果差異無顯著性。也就是說可用手工法代替洗板機法洗板，兩種洗板法得出的結(jié)果都可靠，我們認(rèn)為用手工法洗板更加簡單、，可提高工作效率。筆者對18例弱陽性標(biāo)本進(jìn)行了重復(fù)檢測，并用手工法和洗板機法兩種方法洗板測定，其中有3例弱陽性標(biāo)本經(jīng)重復(fù)檢測后為陰性，確定為假陽性，假陽性占753例樣本中的0.39%，假陽性往往顯色都較弱，表現(xiàn)為弱陽性。弱陽性的出現(xiàn)，主要是由于標(biāo)本沒有處理好造成，伴有溶血或其他因素引起血清渾濁較為常見，而這些樣品在HBsAg的ELISA檢測中常出現(xiàn)假陽性［2］，纖維蛋白、紅細(xì)胞、標(biāo)本溶血是弱陽性發(fā)生的主要原因。尤其是纖維蛋白可非特異性地吸附在載體上，并吸附酶標(biāo)抗體，難于*洗脫，因此，標(biāo)本要充分凝固，離心要充分，使血清分離良好，吸樣時不要吸到紅細(xì)胞。如標(biāo)本溶血較嚴(yán)重，建議重新取樣，因為血紅蛋白中含有血紅素基團，其有類似過氧化物酶的活性，在以辣根過氧化物酶（HRP）為標(biāo)記酶的ELISA測定中，如血清標(biāo)本中血紅蛋白濃度過高，則其很容易在溫育過程中吸附于固相上，從而與隨后加入的HRP底物反應(yīng)顯色［3］。在假陰性方面，753例檢測中，都做雙孔陽性對照，結(jié)果兩種洗板方法都未出現(xiàn)陽性對照陰性結(jié)果的現(xiàn)象，可見手工洗板法不會出現(xiàn)假陰性的現(xiàn)象。用手工法洗板經(jīng)濟、實用，只需一個臉盆，一個特建的洗滌池，成本非常低，并可長期使用，其經(jīng)濟實用不言而喻；而全自動洗板機，價格昂貴，對于基層醫(yī)院是個不小的負(fù)擔(dān)；對于大醫(yī)院或繁忙的醫(yī)院，則要多臺同時使用，且容易堵塞、出故障，給工作帶來不便，其維護(hù)、保養(yǎng)、維修也是一個不小的負(fù)擔(dān)。在控制感染性醫(yī)療廢物方面，只要嚴(yán)格要求，將使用后的洗滌液也倒入洗滌池之中，按2 500 mg/L的濃度，加入健之素，浸泡24 h，然后收集，交醫(yī)療廢物處理公司處理，則*可以控制感染。沖板用的自來水，只要符合國家自來水供水標(biāo)準(zhǔn)，便可使用，但洗板開始前，應(yīng)打開自來水開關(guān)，讓自來水空流1 min～2 min，以使沉積的臟水流去。遇自來水混濁時，不可使用。綜上所述，在酶聯(lián)免疫試劑盒方法檢驗當(dāng)中，手工法洗板和洗板機洗板，沒有本質(zhì)上的差別，兩種方法結(jié)果都可靠。但手工法簡單、經(jīng)濟、、實用，值得規(guī)范、推廣。