離子交換色譜

【資料簡介】

實驗方法原理    
離子交換色譜是將離子交換基因（CM、SP、Q、DEAE等）鍵合于一定的惰性載體（纖維素、交聯(lián)葡聚糖，交聯(lián)瓊脂糖等）之上，并以此作為固定相，依據(jù)樣品所帶電荷的不同，從而與固定相上的離子交換基團相互作用的程度不同而進行分離的一種色譜方法。離子交換色譜技術已廣泛用于蛋白質(zhì)、多肽、寡核苷酸、病毒、噬菌體、多糖等的純化。
 
離子交換劑是在載體上鍵合了一些離子交換基團，而離子交換基團在水溶液中通過電離釋放出游離的離子，這些離子可帶正電或帶負電，可以被溶液中的其它帶相同電荷的離子取代，并對離子交換劑有較強的結(jié)合力。結(jié)合力的大小不僅受離子與離子交換劑之間作用力的影響，而且主要受離子濃度的影響，這個過程中的作用力是靜電引力，離子交換的原理是靜電相互作用。
 
蛋白質(zhì)在離子交換色譜上的保留時間取決于蛋白質(zhì)在相應色譜條件下所帶靜電荷的多少，而蛋白質(zhì)所帶靜電荷的多少是由蛋白質(zhì)分子的pI和所處溶液環(huán)境的pH共同決定的。在酸性條件下，蛋白質(zhì)帶正電荷；在堿性條件下，蛋白質(zhì)帶負電荷。在陽離子交換柱上，只有pI大于流動相pH的蛋白質(zhì)在柱子上保留，而pI小于或等于流動相pH的蛋白質(zhì)不保留，即使它們的pI值彼此之間有差異，也都作為溶劑峰同時被直接沖洗出來。而被保留的蛋白質(zhì)出峰順序則是pI小的先出峰，pI大的后出峰。在陰離子交換柱上情況則恰恰相反。
 
過程分為四個階段：平衡-吸附-解吸附-再生，其中吸附和解吸附是主要階段，現(xiàn)以純化TNF過程中應用的Q-Sepharose FF和SP-Sepharose FF為例說明。
 
實驗材料    TNF
試劑、試劑盒    Tris-HCl EDTAPB緩沖液硫酸銨透析
儀器、耗材    透析袋離心機離心管移液槍槍頭陰離子交換基質(zhì)Q-Sepharose FF蛋白檢測儀陽離子柱SP-Sepharose FF試管
實驗步驟    
一、試劑的配制 
 
1.  配制pH8.5 20 mmol/L Tris-HCl含1mmol/L EDTA溶液（或其貯備液，臨用時稀釋即可）濾后使用。
 
2.  配制pH7.5 20 mmol/L的PB緩沖液，過濾后使用。
 
二、操作步驟 
 
1.  樣品的預處理
 
2.  樣品的平衡
 
將實驗一中50%飽水硫酸銨沉淀、離心得到的上清液，置于透析袋中，于20～40倍體積的pH8.5 20 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA的緩沖液中，4℃攪拌透析24 h，中間換透析液3～4次，4℃ 12 000 rpm離心15 min，收集上清，測定蛋白濃度，記錄體積。
 
3.  陰離子柱Q-Sepharose FF的平衡及上樣
 
取陰離子交換基質(zhì)Q-Sepharose FF裝柱，柱體積5.4×20 cm用pH8.5 20 mmol/L Tris-HCl 1 mmol/L EDTA 緩沖液流洗平衡層析柱，調(diào)整好蛋白檢測儀的量程及記錄儀靈敏度。將收集的上清液以8 ml/min流速上樣。平衡緩液沖直至流出液吸光值恢復至基線。收集穿過峰，量體積，測蛋白含量。
 
4.  洗脫
 
洗脫液A為pH8.5 20 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA緩沖液，洗脫液B為含終濃度為1 mol/L NaCl的A液進行線性梯度洗脫（根據(jù)純化條件設定的純化工藝），收集各洗脫峰量體積，測蛋白濃度，進行SDS-PAGE或進行活性鑒定TNF所在峰。
 
5.  將活性峰用pH7.5 20 mmol/L PB透析24 h，中間換液3次。離心，取上清并量其體積，測蛋白濃度。
 
6.  陽離子柱SP-Sepharose FF的平衡及上樣
 
取陽離子交換基質(zhì)SP-Sepharose FF裝柱，柱體積2.5×10 cm，用pH7.5 20 mmol/L PB緩沖液流洗平衡層析柱，調(diào)整好蛋白檢測儀的量程及記錄儀的靈敏度，將透析、離心后的TNF的峰液以4 ml/min的流速上樣，用平衡液洗至基線，收集穿過峰，量體積，測蛋白濃度。
 
7.  洗脫
 
陽離子層析柱SP-Sepharose FF的洗脫液A為pH7.5 20 mmol/L PB，洗脫液B為含1 mol/L NaCl的A液進行線性梯度洗脫，收集各洗脫峰，量體積，測蛋白質(zhì)濃度，進行SDS-PAGE或活性鑒定。
 
8.  后處理
 
進行TNF的純度、活性等鑒定，按要求分裝加賦形劑冷凍干燥后制成一定效價的TNF產(chǎn)品。
 
 
 
 
收起 
其他    
一、離子交換劑的選擇 
 
1.  劑型的選擇
 
在決定選擇離子交換劑的類別之前，先要了解所研究的生物大分子保持生物活性和可溶解性的pH范圍，然后根據(jù)其等電點以及其在上述pH范圍內(nèi)的電泳行為觀察大分子的帶電情況，再據(jù)此選擇合適的離子交換劑。具體方法是；在流動相pH條件下進行電泳，向陽極泳動的蛋白質(zhì)，可被陰離子交換劑吸附，因此，選擇陰；反之，向陰極泳動的蛋白質(zhì)，可被陽離子交換劑吸附，應選擇陽。
 
通常，弱離子交換劑用來分離高靜電作用力的蛋白質(zhì)，強離子交換劑用來分離低靜電作用力的蛋白質(zhì)。
 
2.  粒度的選擇
 
離子交換劑粒度的大小對吸附量的影響不大，主要是對分辨率和流速產(chǎn)生影響。用粗顆粒填料填充的柱子不緊密，顆粒間隙大，容易引起區(qū)帶擴散；由于顆粒大，同樣吸附量的粗顆粒占柱床體積大，使形成的峰變寬。這些都會導致色譜分辨率下降。但是顆粒大流速快，分離速度快，使純化時間縮短。細顆粒填料可填充成為致密的吸附床，分辨率高，但流速慢，柱壓高。我們可根據(jù)自己工作的需要進行選擇，如果為保持欲分離組分的生物學活性需要縮短分離時間，在大量制備基因工程產(chǎn)品時，可選用粗顆粒。如果要得到高分辨率，可選用超細顆粒。通常我們在實驗室工作中采用的是細或中等粗細的顆粒。
 
3.  緩沖液的選擇
 
在中，選擇合適的緩沖體系，保持準確的流動相pH值更顯得尤為關鍵。選擇緩沖液時應滿足以下要求：
（1）不破壞蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，不影響蛋白的活性。
（2）對人體無毒無害。
（3）緩沖容量大，在所選擇pH范圍內(nèi)有足夠緩沖能力的前提下，離子濃度越小越好。
（4）使用陽離子交換時應用陰離子緩沖劑，使用陰離子交換時應用陽離子緩沖劑，以避免不必要的離子交換過程。
（5）不干擾對分離物的鑒定。
 
目前陽常用緩沖液離子有烷基胺、氨基乙醇胺、乙二胺、咪唑、Tris，吡啶等，其中Triszui為常用；陰常用的緩沖液離子有醋酸鹽、*酸鹽、檸檬酸鹽、*，磷酸鹽等，其中醋酸鹽和磷酸鹽zui為常用。
 
在實際工作中，我們根據(jù)不同的流動相 pH條件來決定采用何種緩沖體系。例如：流動相pH3-5時，我們采用甲酸銨緩沖液；流動相pH4-6時，我們采用醋酸鈉或*緩沖液；流動相pH6-8時，我們采用磷酸鈉或磷酸鉀緩沖液。此外，Tris-鹽酸緩沖液的pH范圍為7-9，Tris-磷酸緩沖液的pH范圍為6-9，我們都經(jīng)常選用。
 
4.  洗脫方式的選擇
 
洗脫方式有三種：一是改變緩沖液pH，使蛋白質(zhì)從吸附狀態(tài)變?yōu)榻馕綘顟B(tài)。如在陰中，通過降低流動相pH使吸附在柱子上的帶負電荷的蛋白質(zhì)帶正電，從而達到解吸附，在陽中則是通過升高流動相pH的方法達到解吸附；二是增加緩沖液的離子強度，將吸附強的分子從離子交換劑上替換下來；三是緩沖液pH和離子強度同時改變。無論哪一種方法，都可用階段洗脫和梯度洗脫兩種方式進行。
 
階段洗脫是用幾個不同pH緩沖液或幾個不同鹽濃度的緩沖液逐步進行洗脫。即pH和離子強度變化不連續(xù)。而在梯度洗脫中，緩沖液的洗脫能力是連續(xù)增加的，由于后者分辨率更好，因此被廣泛采用。
 
在經(jīng)典色譜中需用梯度混合器來制造線性梯度，梯度混合器是由兩個容器構(gòu)成，兩個容器安放在同一個水平上，一個盛起始緩沖液，另一個盛含較高離子強度或不同pH的緩沖液。二者用管子相連，以保持溶液的流體靜力平衡。當緩沖液從*個容器流入柱內(nèi)，第二個容器的緩沖液進入*個容器自動補足，使緩沖液形成梯度。
 
現(xiàn)在許多中低壓色譜儀器（如Waters，Pharmacia等公司的一些產(chǎn)品）和液相色譜一樣可以用計算機控制雙泵自動配制流動相，很容易地獲得直線或非直線、連續(xù)或非連續(xù)的梯度模式，以滿足不同的分離需要。
 
通常對線性梯度的要求是：
（1）洗脫液的總體積應足夠大，一般梯度至少要四倍床體積，使分離的各個峰有較好的分辨率；
（2）梯度上限要有足夠強的洗脫能力，使吸附的zui緊密的物質(zhì)也能夠從柱子上被洗脫下來；
（3）梯度的斜率不應太大，以確保各峰能夠分開，但又不應太小，以免峰形過寬甚至形成拖尾；一般認為，梯度體積越大，梯度變化越緩，則分辨率越好。
 
二、實驗操作
 
1.  填料的預處理
 
2.  裝柱
 
不同于凝膠色譜，柱子通常較為短小，對于一般工作，通常選長度為10-40cm的柱已足夠。柱的直徑按照欲分物質(zhì)的數(shù)量來選定。對于很復雜的混合物和進行精細分析是用細長的柱，分辨率較好；對于初步分離可用較粗、容量較大的柱。裝好的柱子用起始緩沖液充分平衡后上樣。
 
3.  上樣
 
柱必須充分平衡后方可上樣。上樣量取決于色譜柱的交換容量，一般為交換容量的70-80%，上樣體積可以不受限制。通常低濃度樣品上樣可達床體積的幾倍到幾百倍。這一點對較稀的樣品極為有利，可以同時起到分離和濃縮的雙重作用，可謂一舉兩得。但用于分析時，為了提高分辨率，上樣量體積適當減小。用于分離的樣品溶液的離子強度和pH值必須與起始緩沖液（即流動相A液）一致，如不一致，應進行緩沖液轉(zhuǎn)換，可通過透析或凝膠色譜來完成。
 
4.  洗脫、樣品收集
 
加樣后用足夠量的起始緩沖液洗滌除去不吸附的物質(zhì)，然后再進行洗脫。洗脫可選擇不同的方法，用控制器或梯度混合器控制梯度。流出的樣品組分經(jīng)紫外檢測器實時檢測（檢測波長一般為280 nm），用分部收集器或手工收集。
 
5.  再生
 
樣品洗脫完畢后要進行再生，以除去仍然結(jié)合在柱子上未*洗下的一些蛋白質(zhì)，通常用*流動相B液再洗脫1個柱體積即可。
 
6. 平衡
 
再生后的柱子欲再次進樣需重新進行平衡，平衡一般用*A液（即0%B液）洗滌柱子至少四個柱體積。
 
7.  保存
 
柱子不用時應用強洗脫劑洗去結(jié)合于柱子上的雜質(zhì)，然后再用蒸餾水*清洗后加抑菌劑保存。