染色質(zhì)免疫共沉淀

【資料簡介】

實驗方法原理    在保持組蛋白和DNA聯(lián)合的同時，通過運用對應于一個特定組蛋白標記的生物抗體，染色質(zhì)被切成很小的片斷，并沉淀下來。

IP是利用抗原蛋白質(zhì)和抗體的特異性結(jié)合以及細菌蛋白質(zhì)的“prorein A”特異性地結(jié)合到免疫球蛋白的FC片段的現(xiàn)象活用開發(fā)出來的方法。

目前多用精制的prorein A預先結(jié)合固化在argarose的beads上，使之與含有抗原的溶液及抗體反應后，beads上的prorein A就能吸附抗原達到精制的目的。

實驗材料    細胞樣品
試劑、試劑盒    甲醛*PBSSDS Lysis Buffer洗脫液RNaseA蛋白酶Komega膠回收試劑盒
儀器、耗材    離心管超聲儀電泳儀離心機
實驗步驟    
一、細胞的甲醛交聯(lián)與超聲破碎（ *天）
 
1.  取出1平皿細胞（10 cm平皿），加入243 ul 37%甲醛，使得甲醛的終濃度為1%（培養(yǎng)基共有9 ml）。
 
2.  37℃孵育10 min。
 
3.  終止交聯(lián)：加*至終濃度為0.125 M。450 ul 2.5 M*于平皿中。混勻后，在室溫下放置5 min即可。
 
4.  吸盡培養(yǎng)基，用冰冷的PBS清洗細胞2次。
 
5.  細胞刮刀收集細胞于15 ml離心管中（PBS依次為5 ml，3 ml和3 ml）。預冷后2 000 rpm 5 min收集細胞。
 
6.  倒去上清。按照細胞量，加入SDS Lysis Buffer。使得細胞終濃度為每200ul含2×106個細胞。這樣每100 ul溶液含1×106個細胞。再加入蛋白酶抑制劑復合物。假設(shè)MCF7長滿板為5×106個細胞。本次細胞長得約為80%。即為4×106個細胞。因此每管加入400 ul SDS Lysis Buffer。將2管混在一起，共800 ul。
 
7.  超聲破碎：VCX750，25%功率，4.5 s沖擊，9 s間隙。共14次。
 
二、除雜及抗體哺育 （ *天）
 
1.  超聲破碎結(jié)束后，10 000 g 4℃離心10 min。去除不溶物質(zhì)。
 
2.  留取300ul做實驗，其余保存于-80℃。
 
3.  300 ul中，100 ul加抗體做為實驗組；100 ul不加抗體做為對照組；100 ul加入4 ul 5 M NaCl（NaCl終濃度為0.2 M），65℃處理3 h解交聯(lián)，跑電泳，檢測超聲破碎的效果。
 
4.  在100 ul的超聲破碎產(chǎn)物中，加入900 ul ChIP DilutionBuffer和20 ul的50×PIC。
 
再各加入60 ul ProteinA Agarose/SalmonSpermDNA。4℃顛轉(zhuǎn)混勻1 h。
 
5.  1 h后，在4℃靜置10 min沉淀，700 rpm離心1 min。
 
6.  取上清。各留取20 ul做為input。一管中加入1 ul抗體，另一管中則不加抗體。4℃顛轉(zhuǎn)。
 
三、檢驗超聲破碎的效果 （ *天）
 
1.  取100 ul超聲破碎后產(chǎn)物，加入4 ul 5M NaCl，65℃處理2 h解交聯(lián)。

2.  分出一半用酚/氯仿抽提。電泳檢測超聲效果。
 
四、免疫復合物的沉淀及清洗（ 第二天）
 
1.  孵育后，每管中加入60 ul ProteinA  Agarose/SalmonSperm DNA。4℃顛轉(zhuǎn)2 h。
 
2.  4℃靜置10 min后，700 rpm離心1 min。除去上清。
 
3.  依次用下列溶液清洗沉淀復合物。清洗的步驟：加入溶液，在4℃顛轉(zhuǎn)10 min，4℃靜置10 min沉淀，700 rpm離心1 min，除去上清。
 
洗滌溶液：

（1）low salt wash buffer-one wash
 
（2）highsalt wash buffer-one wash
 
（3）LiCl wash buffer-one wash
 
（4）TE buffer-two wash
 
4.  清洗完畢后，開始洗脫。

洗脫液的配方：100 ul 10%SDS，100 ul1M NaHCO3，800 ul ddH2O，共1 ml。
 
每管加入250 ul洗脫buffer，室溫下顛轉(zhuǎn)15 min，靜置離心后，收集上清。重復洗滌一次。zui終的洗脫液為每管500 ul。
 
5.  解交聯(lián)：每管中加入20 ul 5M NaCl（NaCl終濃度為0.2 M）。
 
6.  混勻，65℃解交聯(lián)
。
 
五、DNA樣品的回收（第三天）
 
1.  解交聯(lián)結(jié)束后，每管加入1 ul RNaseA（MBI），37℃孵育1 h。
 
2.  每管加入10 ul 0.5 M EDTA，20 ul1M Tris.HCl（PH6.5），2 ul 10 mg/ml蛋白酶K。45℃處理2 h。
 
3.  DNA片段的回收----omega膠回收試劑盒。zui終的樣品溶于100 ul ddH2O。
 
六、PCR分析（第三天）
 
 
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注意事項    
1. 注意抗體的性質(zhì)。抗體不同和抗原結(jié)合能力也不同，免染能結(jié)合未必能用在IP反應。建議仔細檢查抗體的說明書。特別是多抗的特異性是問題。

2.  注意溶解抗原的緩沖液的性質(zhì)。多數(shù)的抗原是細胞構(gòu)成的蛋白，特別是骨架蛋白，緩沖液必須要使其溶解。為此，必須使用含有強界面活性劑的緩沖液，盡管它有可能影響一部分抗原抗體的結(jié)合。另一面，如用弱界面活性劑溶解細胞，就不能充分溶解細胞蛋白。即便溶解也產(chǎn)生與其它的蛋白結(jié)合的結(jié)果，抗原決定族被封閉，影響與抗體的結(jié)合，即使IP成功，也是很多蛋白與抗體共沉的悲慘結(jié)果。

3.  為防止蛋白的分解，修飾，溶解抗原的緩沖液必須加蛋白每抑制劑，低溫下進行實驗。每次實驗之前，首先考慮抗體/緩沖液的比例?？贵w過少就不能檢出抗原，過多則就不能沉降在beads上，殘存在上清。緩沖劑太少則不能溶解抗原，過多則抗原被稀釋。
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其他    
一、染色質(zhì)免疫共沉淀簡介 

真核生物的基因組DNA以染色質(zhì)的形式存在。因此，研究蛋白質(zhì)與DNA在染色質(zhì)環(huán)境下的相互作用是闡明真核生物基因表達機制的基本途徑。染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)（chromatin immunoprecipitation assay, CHIP）是目前*研究體內(nèi)DNA與蛋白質(zhì)相互作用的方法。它的基本原理是在活細胞狀態(tài)下固定蛋白質(zhì)－DNA復合物，并將其隨機切斷為一定長度范圍內(nèi)的染色質(zhì)小片段，然后通過免疫學方法沉淀此復合體，特異性地富集目的蛋白結(jié)合的DNA片段，通過對目的片斷的純化與檢測，從而獲得蛋白質(zhì)與DNA相互作用的信息。CHIP不僅可以檢測體內(nèi)反式因子與DNA的動態(tài)作用，還可以用來研究組蛋白的各種共價修飾與基因表達的關(guān)系。而且，CHIP與其他方法的結(jié)合，擴大了其應用范圍：CHIP與基因芯片相結(jié)合建立的CHIP-on-chip方法已廣泛用于特定反式因子靶基因的高通量篩選；CHIP與體內(nèi)足跡法相結(jié)合，用于尋找反式因子的體內(nèi)結(jié)合位點；RNA-CHIP用于研究RNA在基因表達調(diào)控中的作用。由此可見，隨著CHIP的進一步完善，它必將會在基因表達調(diào)控研究中發(fā)揮越來越重要的作用。

二、ChIP的一般流程
 
甲醛處理細胞---收集細胞，超聲破碎---加入目的蛋白的抗體，與靶蛋白-DNA復合物相互結(jié)合---加入ProteinA，結(jié)合抗體-靶蛋白-DNA復合物，并沉淀---對沉淀下來的復合物進行清洗，除去一些非特異性結(jié)合---洗脫，得到富集的靶蛋白-DNA復合物---解交聯(lián)，純化富集的DNA-片斷---PCR分析。
 
三、PCR分析

ChIP-chip技術(shù)對于大規(guī)模挖掘順式調(diào)控信息成績，同時它可以用于胚胎干細胞和一些疾病如癌癥、心血管疾病和*神經(jīng)紊亂的發(fā)生的機制。研究人員還可以利用這項技術(shù)開發(fā)一些治療方法。目前ChIP-chip技術(shù)研究主要集中于兩個領(lǐng)域：及轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合和條件特異性；組蛋白的修飾，組蛋白修飾蛋白和染色體重建。
 
ChIP-chip在描述轉(zhuǎn)錄結(jié)合因子動力學中的研究、染色體結(jié)構(gòu)組分的分布、在組蛋白的修飾、組蛋白修飾蛋白和染色體重建中的應用也十分廣泛。ChIP-chip 技術(shù)的優(yōu)點是，可以在體內(nèi)進行反應；在給定的檢驗細胞環(huán)境的模式下得到DNA相互關(guān)系的簡單影像；使用特異性修正抗體鑒定與包含有一個特異性后轉(zhuǎn)錄修正的蛋白質(zhì)的相關(guān)位點；直接或者間接（通過蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用）的鑒別基因組與蛋白質(zhì)的相關(guān)位點。缺點是：需要一個特異性蛋白質(zhì)抗體，有時難于獲得；為了獲得高豐度的結(jié)合片段，必須實驗演示胞內(nèi)條件下靶標蛋白質(zhì)的表達情況；調(diào)控蛋白質(zhì)的基因的獲取可能需要限制在組織來源中。
 
總之，ChIP-chip 技術(shù)的發(fā)展為析活細胞或組織中DNA與蛋白質(zhì)的相互關(guān)系提供了一個極為有力的工具。在未來的研究中，將對芯片的構(gòu)建進行改進，提高其實用性。使用易于獲得抗體，增加這種方法的可用性。

在PCR分析這一塊，比較傳統(tǒng)的做法是半定量-PCR。但是現(xiàn)在隨著熒光定量PCR的普及，大家也越來越傾向于Q-PCR了。此外還有一些由ChIP衍生出來的方法。例如RIP（其實就是用ChIP的方法研究細胞內(nèi)蛋白與RNA的相互結(jié)合，具體方法和ChIP差不多，只是實驗過程中要注意防止RNase，zui后分析的時候需要先將RNA逆轉(zhuǎn)錄成為cDNA）；還有ChIP-chip（其實就是ChIP富集得到的DNA-片段，拿去做芯片分析，做法在ChIP的基礎(chǔ)上有所改變，不同的公司有不同的做法，要根據(jù)公司的要求來準備樣品）。