細(xì)胞爬片制備詳細(xì)過程

【資料簡介】

【爬片的準(zhǔn)備】

1.爬片可用一般的蓋玻片，也可用爬片；

 

2.應(yīng)用蓋玻片，可根據(jù)自己的需要剪裁成合適的大小，以備置于6孔板、12孔板或24孔板；裁剪時(shí)可用前護(hù)士輸液用于打開玻璃安瓶的小沙輪，或者是口腔科的那種小沙輪，輕輕劃一下后，稍用力一掰就分開了。

 

如果接種大皿的話，我一般不將蓋玻片切開，直接清潔后放入培養(yǎng)皿中，到染色時(shí)再將之切開，這樣既保證了細(xì)胞均一性，又可同時(shí)做幾個(gè)指標(biāo)的染色。

 

3.將剪裁好的爬片，置于濃硫酸中浸泡并過夜，第二天先用自來水沖洗20遍，再置于無水酒清中浸泡6小時(shí)，再用三蒸水沖洗3遍（個(gè)人認(rèn)為主要目的是將酸沖洗干凈就可以了，如果不干凈的話，細(xì)胞帖壁不好），放在飯盒或者玻璃培養(yǎng)皿中烘干后進(jìn)行高壓消毒。

 

4.高壓后取出放入烤箱中烤干，備用?？靖珊罂煞湃氤瑑襞_(tái)中。

 

5.關(guān)于多聚賴氨酸，很多人都將玻片用此處理，以使細(xì)胞與玻片結(jié)合更牢。但我在做爬片時(shí)從來沒用過多聚賴氨酸，細(xì)胞貼壁仍然很好，且在做后續(xù)的免疫細(xì)胞化學(xué)染色、TUNEL等凋亡檢測、免疫熒光等也從未脫過片。

 

 

 

【細(xì)胞爬片】

 

1.*消化細(xì)胞后計(jì)數(shù)重懸細(xì)胞于*培養(yǎng)基中。

 

2.加細(xì)胞時(shí)，根據(jù)玻片的大小，先在每個(gè)孔里準(zhǔn)備放爬片的位置滴少量培養(yǎng)基，目的是使玻片與培養(yǎng)皿靠培養(yǎng)基的張力粘合到一起，然后放玻片，防止加細(xì)胞懸液時(shí)玻片漂起，造成雙層細(xì)胞貼片。整個(gè)過程注意無菌操作。

 

3.根據(jù)自己的需要選擇合適的細(xì)胞密度種入培養(yǎng)板內(nèi)即可

 

4.待細(xì)胞貼壁后，可去上清加含藥培養(yǎng)基。

 

5.按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，作用一定時(shí)間后取玻片。取玻片時(shí)由于玻片與培養(yǎng)皿底結(jié)合較緊，張力較大，我一般將注射器針頭針尖向背面弄個(gè)小鉤，這樣將爬片輕輕勾起，用小鑷子取出就可以了。如果要做諸如24h，48h，72h等這樣時(shí)間點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)的話，將所需數(shù)量的爬片取出時(shí)應(yīng)用酒精燈火焰燒一下針頭和鑷子。末取出的可接著繼續(xù)培養(yǎng)。

 

 

 

 

 

 

【細(xì)胞爬片的固定】

 

細(xì)胞爬片取出后，一般用PBS洗2遍，然后再做固定。當(dāng)然，根據(jù)研究目的，PBS洗也不是一定要做的，比如做凋亡的TUNEL染色時(shí)就避免洗，因?yàn)榈蛲龅募?xì)胞在洗的過程中有可能會(huì)脫落。

 

另外在保存細(xì)胞爬片的時(shí)候，我一般用培養(yǎng)皿或板，先在皿底放一層面巾紙，然后再放爬片，這樣方便做實(shí)驗(yàn)時(shí)取片。然后蓋上蓋子，并在蓋子上做標(biāo)記，為避免混淆，可用透明膠帶將蓋子和皿連在一起。一般-20℃保存2-3個(gè)月的片子做免疫組化是沒有問題的。

 

以下為常用的固定液

 

1. 冷丙酮 可用于一般的免疫組化染色。

將純的丙酮預(yù)先放入冰箱-20℃后便為冷丙酮（放心，丙酮在此溫度不會(huì)為固體的）細(xì)胞爬片取出后，PBS洗2遍，便可加入冷丙酮于-20℃（丙酮有很強(qiáng)的揮發(fā)性，注意將含有丙酮和爬片的器皿蓋嚴(yán)，防止其揮發(fā)）固定10分鐘。取出后，室溫吹干，然后放入-20℃保存。

 

2. 多聚甲醛(常用4%)：可用于免疫電鏡；也可用于免疫熒光以及TUNEL染色。 

主要檢測組織內(nèi)一些性能嬌弱的抗原特別是細(xì)胞表面抗原，例如各類淋巴細(xì)胸分化決定簇(CD)、主要組織相容性抗原等

室溫固定15分鐘后，將表面液體吹干，入-20℃保存

 

3. 95％乙醇，可用于免疫組化。

優(yōu)點(diǎn)：穿透性強(qiáng)、抗原性保存較好。

缺點(diǎn)：但醇類對低分子蛋白質(zhì)、多肽及胞漿內(nèi)蛋白質(zhì)保存效果較差，使蛋白變性的作用輕，固定后可再溶解；染色過程中，溫育時(shí)間長，抗原可流失而減弱反應(yīng)強(qiáng)度

室溫固定15分鐘后，將表面液體吹干，入-20℃保存

 

4. 甲醛(福爾馬林)應(yīng)用zui廣 

優(yōu)點(diǎn)：形態(tài)結(jié)構(gòu)保存好，且穿透性強(qiáng)，

缺點(diǎn)： 甲醛放置過久可氧化為甲酸，使溶液pH降低，影響染色； 分子間交聯(lián)形成的網(wǎng)格結(jié)構(gòu)可能部分或*掩蓋某些抗原決定簇，使之不能充分暴露?？稍斐杉訇幮缘娜旧Y(jié)果。

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產(chǎn)品：

bs-0118R	雄激素受體抗體|Androgen receptor
bs-2438R	細(xì)胞死亡調(diào)節(jié)蛋白抗體(凋亡、半胱胺酸蛋白酶激活抑制劑)|AVEN
bs-2439R	軸蛋白1抗體|Axin1
bs-4011R	自噬相關(guān)蛋白9B抗體|ATG9B
bs-4012R	自噬相關(guān)蛋白12抗體|Apg12
bs-3864R	自噬相關(guān)蛋白13抗體|ATG13
bs-4013R	自噬相關(guān)蛋白3抗體|ATG3
bs-4191R	整合素樣金屬蛋白酶與*4型抗體|ADAMTS4
bs-1648R	磷酸化活化復(fù)制因子2抗體|phospho-ATF2 (Ser490/498)
bs-1649R	磷酸化APP(Tyr757)淀粉樣肽前體蛋白抗體|phospho-Amyloid Precursor Protein (Tyr757)
bs-2919R	*/*蛋白激酶ATR抗體|ACTR
bs-5849R	去整合素樣金屬蛋白酶18抗體|ADAM18
bs-1634R	活化轉(zhuǎn)錄因子6抗體|ATF6
bs-1546R	銜接蛋白β抗體|AP2 beta
bs-1600R	銜接蛋白γ/γ-Adaptin抗體|Gamma-Adaptin
bs-2060R	水通道蛋白-9抗體|AQP9
bs-1631R	膜粘連蛋白A3抗體|Annexin A3
bs-1564R	膜粘連蛋白 A4抗體|Annexin IV
bs-12487R	自噬相關(guān)蛋白8A抗體|APG8A
bs-3043R	磷酸化蛋白激酶B抗體|phospho-Akt (Thr450)
bs-5551R	磷酸化腺苷單磷酸活化蛋白激酶α1抗體|phospho-AMPK alpha-1 (Thr198)
bs-2720R	磷酸化蛋白激酶B抗體|phospho-Akt(Thr308)
bs-15407R	脫氧胞苷脫氨酶蛋白抗體|APOBEC3G
bs-13637R	蛋白激酶錨定蛋白13抗體|AKAP13
bs-13638R	AP-1μ2抗體|AP1M2
bs-7348R	肥大細(xì)胞膜抑制性受體Allergin1抗體|Allergin-1
bs-4915R	腦鈉通道蛋白1抗體|ACCN1
bs-10563R	肌動(dòng)蛋白相關(guān)蛋白2/3復(fù)合亞單位B1抗體|ARP2/3 subunit 1B
bs-4780R	三磷酸腺苷結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白G超家族成員2抗體|ABCG2
bs-8616R	甲胎蛋白抗體|alpha 1 Fetoprotein
bs-1370R	毛細(xì)血管擴(kuò)張性共濟(jì)失調(diào)癥突變蛋白抗體|ATM
bs-12441R	ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2抗體|ABCF2
bs-12442R	肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白LIM蛋白3抗體|ABLIM3
bs-12443R	酸性鈣調(diào)蛋白3抗體|Acidic Calponin
bs-12447R	磷酸化CD156b抗體|phospho-ADAM17 (Thr735)
bs-12448R	乙醇脫氫酶5抗體|ADH5
bs-12449R	乙醇脫氫酶6抗體|ADH6
bs-12451R	溶血磷脂?；D(zhuǎn)移酶5抗體|AGPAT5
bs-12452R	遺傳性失明相關(guān)蛋白AIPL1抗體|AIPL1
bs-12453R	免疫調(diào)節(jié)蛋白AIRE抗體|AIRE
bs-12456R	磷酸化蛋白激酶AKT1抗體|phospho-AKT1 (Ser473)
bs-12458R	磷酸化蛋白激酶AKT1抗體|phospho-AKT1 (Thr72)
bs-12459R	磷酸化蛋白激酶AKT1抗體|phospho-AKT1 (Tyr326)
bs-12460R	乙醛脫氫酶2型抗體|ALDH1A2
bs-12461R	γ-氨基丁酸醛脫氫酶抗體|ALDH9A1
bs-12462R	衰老相關(guān)蛋白5抗體|AGPS
bs-12463R	磷酸化熱休克蛋白β5/αb晶體蛋白質(zhì)/α-晶體蛋白b鏈抗體|phospho-alpha B Crystallin (Ser59)
bs-12467R	釉基質(zhì)蛋白抗體|AMBN
bs-12468R	磷酸化腺苷單磷酸活化蛋白激酶α2抗體|phospho-AMPK alpha 2 (Ser176)
bs-12469R	磷酸化腺苷單磷酸活化蛋白激酶α2抗體|phospho-AMPK alpha 2 (Ser491)
bs-12471R	磷酸化雄激素受體抗體|phospho-Androgen Receptor (Ser515)
bs-12472R	磷酸化雄激素受體抗體|phospho-Androgen Receptor (Ser791)
bs-12473R	磷酸化雄激素受體抗體|phospho-Androgen Receptor (Ser94)
bs-12474R	磷酸化雄激素受體抗體|phospho-Androgen Receptor (Tyr363)
bs-12475R	錨定蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域蛋白激酶ANKK1抗體|ANKK1
bs-12961R	磷酸化內(nèi)收蛋白抗體|phospho-alpha Adducin (Thr445)
bs-12477R	膜粘連蛋白11抗體|Annexin A11
bs-12478R	膜粘連蛋白13抗體|Annexin A13
bs-12959R	磷酸化促腎上腺皮質(zhì)激素ACTH抗體|phospho-ACTH (Ser168)
bs-12962R	磷酸化蛋白激酶AKT1抗體|phospho-AKT1 (Ser246)
bs-15963R	磷酸化蛋白激酶B抗體|phospho-AKT1/3 (Tyr473)
bs-15967R	磷酸化鈉鉀ATP酶蛋白a1抗體|phospho-alpha 1 Sodium Potassium ATPase (Tyr260)
bs-15968R	磷酸化內(nèi)收蛋白a1抗體|phospho-alpha Adducin(Ser436)