PCR實驗操作程序

【資料簡介】

1. 在無菌的0.5ml或0.2ml離心管中按下列操作程序加樣：

反應(yīng)物 加樣順序 體積(μl) 終濃度

去離子水 1 29.4
10×Buffer B 2 5 1×
4×dNTP混合物 3 5 各200μmol/L 
MgCl2 4 3 1.5mmol/L
有義引物 5 2.6 0.25μmol/L
反義引物 6 2.6 0.25μmol/L
模板 7 2 0.1μg
Taqdna聚合酶 8 0.4 1unit

2. 用微量可調(diào)加樣器和一次性tip向每一管中加50μl礦物油。每加一管換一次Tip。
3. 振蕩每只管，然后短暫離心。
4. 將管放到預(yù)熱的熱循環(huán)中，按下列程序開始循環(huán)：
預(yù)變性 94℃ 4分鐘 1次

變性 94℃ 1分鐘
退火 37-65℃ 1分鐘
延伸 72℃ 1分鐘
循環(huán)30次

終延伸 72℃ 7分鐘 1次
保存 4℃ 
5. 將PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，分析結(jié)果。電泳條件：60-80V,15-20分鐘。
6. 紫外分析儀檢查電泳結(jié)果。

四、討論

1.假陰性，不出現(xiàn)擴增條帶
PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有①模板核酸的制備，②引物的質(zhì)量與特異性，③酶的質(zhì)量，④PCR循環(huán)條件。尋找原因亦應(yīng)針對上述環(huán)節(jié)進行分析研究。
模板：①模板中含有Taq酶抑制劑，②在提取制備模板時丟失過多，或吸入酚。③模板核酸變性不*。在酶和引物質(zhì)量好時，不出現(xiàn)擴增帶，有可能是模板核酸提取過程出了毛病，可使用陽性對照的DNA模板配合檢查模板質(zhì)量。
酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而導(dǎo)致假陰性。
引物：引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱，是PCR失敗或擴增條帶不理想、容易彌散的常見原因。有些批號的引物合成質(zhì)量有問題，兩條引物一條濃度高，一條濃度低，造成低效率的不對稱擴增，對策為：①選定一個好的引物合成單位。②引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現(xiàn)，而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無條帶，此時做PCR有可能失敗，應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時要平衡其濃度。③引物應(yīng)高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或放冰箱冷藏，導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失效。④引物設(shè)計不合理，如引物長度不夠，引物之間形成二聚體等。
Mg2+濃度：Mg2+離子濃度對PCR擴增效率影響很大，濃度過高可降低PCR擴增的特異性，濃度過低則影響PCR擴增產(chǎn)量甚至使PCR擴增失敗而不出擴增條帶。
反應(yīng)體積的改變：通常進行PCR擴增采用的體積為20ul、30ul、50ul、或100ul，應(yīng)用多大體積進行PCR擴增，是根據(jù)科研和臨床檢測不同目的而設(shè)定，在做小體積如20ul 后，再做大體積時，一定要模索條件，否則容易失敗。
物理原因：變性對PCR擴增來說相當重要，如變性溫度低，變性時間短，極有可能出現(xiàn)假陰性;退火溫度過低，可致非特異性擴增而降低特異性擴增效率，退火溫度過高影響引物與模板的結(jié)合而降低PCR擴增效率。有時還有必要用標準的溫度計，檢測一下 擴增儀或水溶鍋內(nèi)的變性、退火和延伸溫度，這也是PCR失敗的原因之一。
靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結(jié)合，或因靶序列某段缺失使引物與模板失去互補序列，其PCR擴增是不會成功的。

2.假陽性
出現(xiàn)的PCR擴增條帶與目的靶序列條帶一致，有時其條帶更整齊，亮度更高。
引物設(shè)計不合適：選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性，因而在進行PCR擴增 時，擴增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽性。需重新設(shè)計引物。
靶序列或擴增產(chǎn)物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個基因組或大片段的交叉污染，導(dǎo)致假陽性。這種假陽性可用以下方法解決：①操作時應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或濺出離心管外。②除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及樣進槍頭等均應(yīng)一次性使用。③必要時，在加標本前，反應(yīng)管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性?？苫ハ嗥唇?，與引物互補后，可擴增出PCR產(chǎn)物，而導(dǎo)致假陽性的產(chǎn)生，可用巢式PCR方法來減輕或消除。

3.出現(xiàn)非特異性擴增帶
PCR擴增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計的大小不一致，或大或小，或者同時出現(xiàn)特異性擴增帶與非特異性擴增帶。非特異性條帶的出現(xiàn)，其原因：一是引物與靶序列不*互補、或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低，及PCR循環(huán)次數(shù)過多有關(guān)。其次是酶的質(zhì)和量，往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶則不出現(xiàn)，酶量過多有時也會出現(xiàn)非特異性擴增。其對策有：①必要時重新設(shè)計引物。②減低酶量或調(diào)換另一來源的酶。③降低引物量，適當增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。④適當提高退火溫度或采用二溫度點法(93℃變性，65℃左右退火與延伸)。

4.出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶
PCR擴增有時出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質(zhì)量 差，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環(huán)次數(shù)過多引起。其對策有：①減少酶量，或調(diào)換另一來源的酶。②減少dNTP的濃度。③適當降低Mg2+濃度。④增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。