GFAPELISA試劑盒說明

【資料簡介】

GFAPELISA試劑盒說明
該試劑盒以HRP 標(biāo)記的鏈霉親和素復(fù)合物（HRP Streptavidin Conjugate，
HRP-SA）為基礎(chǔ)，可用于檢測細(xì)胞、組織內(nèi)的特異性GFAP 抗原。該試劑盒具有
靈敏度高、特異性強(qiáng)、定性定位準(zhǔn)確、背景清晰。在所用的GFAP 一抗與相應(yīng)靶
抗原結(jié)合后，用生物化二抗與一抗特異性結(jié)合，zui后加入HRP-SA，形成抗原—
特異一抗—化二抗—HRP-SA 復(fù)合物，顯微鏡下觀察成像。
試劑盒所含試劑：
試劑A 通透液：0.% Triton-X 00 0 mL（選用）
試劑B 封閉緩沖液（封閉用）20 mL
試劑C （*分裝）已稀釋的即用型GFAP 一抗（2.5ml）
試劑D （*分裝）化羊抗兔IgG 支
（濃度.5 mg/mL，稀釋比為:300~:500）50 μL+抗體稀釋液20ml
試劑E HRP-SA 復(fù)合物 支（濃度 μM，稀釋比:50~:200）00 μL
試劑F DAB 顯色液5ml
用戶自備試劑：
．0mM TBS（pH7.2~7.4）
三羥基氨基甲烷.2g
氯化鈉7.6g
加蒸餾水800mL，濃鹽酸調(diào)pH 值至7.2~7.4，zui后定容至000mL
TBS-T：TBS+Tween 20（0.05%體積比）
2．抗原修復(fù)液（依檢測抗原不同而選擇不同的修復(fù)液）
0mM pH6.0 檸檬酸緩沖液
檸檬酸0.38g
檸檬酸三鈉2.45g
加蒸餾水900mL，濃鹽酸調(diào)pH 值至6.0，zui后定容至000mL
或：0.5M EDTA 修復(fù)液（pH8.0）
EDTA·2H2O 86.g
檸檬酸三鈉2.45g
加蒸餾水700mL，用0mM NaOH 調(diào)pH 值至8.0，zui后定容至000Ml
3. 緩沖甘油封固劑0 mL
4. Tween 20 5 mL
石蠟包埋組織切片免疫染色
實(shí)驗(yàn)步驟（建議方案）：
石蠟包埋組織切片3~4μm 厚度
.烤片：將待做切片置于切片架上，于60℃恒溫烤箱中至少烤 hr；
2.脫蠟：切片放入盛有二甲苯的容器中脫蠟3 次（即二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ），每次
0 min；
3.水化：切片經(jīng)下行酒精水化，無水乙醇5min，95%乙醇2 次（每次2min），85%
乙醇2 min；75%乙醇2min，自來水沖洗，ddH2O 洗2×2min；
4.抗原修復(fù)：根據(jù)抗體說明書方法進(jìn)行抗原修復(fù)，常采用高壓、微波（溫
度達(dá)到98~00℃）或酶消化修復(fù)法，室溫自然冷卻，自來水沖洗，ddH2O 洗2×
2min，TBS 洗滌（2×2min）（具體修復(fù)方法見附）* 注：有些抗原勿需修復(fù)，
直接進(jìn)入第5 步封閉。
5.封閉：滴加試劑B，37℃濕盒孵育30 min；
6.加一抗：滴加用試劑C（即用型一抗），37℃濕盒孵育2 hr 或4℃過夜；
7.洗滌：TBS-T 洗滌（3×5 min）；
8.封閉：滴加試劑B，37℃濕盒孵育0 min；
9.加二抗：滴加用抗體稀釋液稀釋的化二抗（試劑D），37℃濕盒中孵育
30 min；
0.洗滌：TBS-T 洗滌（3×5 min）；
.封閉：滴加試劑Tween 20，37℃濕盒孵育封閉20 min；
2.加HRP-SA：滴加用試劑C 稀釋的試劑E（：50~200，終濃度5~20 nM），37
℃濕盒中孵育30 min；
3.洗滌：TBS-T 洗滌（3×5 min），TBS 洗滌（2×5 min）；
4.顯色：應(yīng)用DAB 溶液（試劑F）顯色；
5.復(fù)染：自來水充分沖洗，復(fù)染，脫水，透明；
6.封片：待組織標(biāo)本干后，用試劑緩沖甘油封固劑封片；
7.觀察成像：顯微鏡下觀察成像。
注意事項(xiàng)：
. 修復(fù)后緩沖液須自然冷卻，自來水沖洗后方能把切片取出，驟冷有可能導(dǎo)致
結(jié)晶或抗原封閉。
2. 緩沖液的量必須保證所有切片都能浸泡到，用過的檸檬酸緩沖液不能反復(fù)使
用。
3. 若試劑為微量濃縮液，用前應(yīng)低速離心，將內(nèi)蓋和管壁附著的溶液離到底部。
4. 封片前一定要換用TBS 充分洗滌，以便洗去組織上殘留的Tween 20，否則會
影響結(jié)果觀察。
5. 如須復(fù)染細(xì)胞核，則在封片前復(fù)染或直接采用含有染核試劑的封片劑進(jìn)行封
片。
附：
抗原修復(fù)方法
常用抗原修復(fù)液：檸檬酸緩沖液（0.0M pH6.0）、EDTA 抗原修復(fù)液（pH8.0 或9.0）
等等。
一、酶消化修復(fù)法
切片脫蠟水化處理，TBS 沖洗，在組織上滴加或，37℃孵育
20~30min 后TBS 沖洗即可。
二、微波抗原修復(fù)法
微波盒中加入抗原修復(fù)液微波加熱至沸騰，將脫蠟水化后的切片置于耐高溫塑料
切片架上，放入已沸騰的緩沖液中，中檔或繼續(xù)微波0~5min，取出微波
盒冷卻至室溫后，自來水沖洗，取出切片。因不同微波爐微波處理時(shí)間存在差異，
須自行調(diào)整。
三、直接高壓抗原修復(fù)法
取修復(fù)液于不銹鋼高壓鍋中加熱至沸騰，將組織切片置于耐高溫切片架上，修復(fù)
液沸騰后放入切片架，蓋上鍋蓋，待噴氣后計(jì)時(shí).5~2.5min 即可脫離熱源，自
然冷卻至室溫后自來水沖洗，取出切片。此方法適用于較難檢測或核抗原的修復(fù)。
四、隔水式高壓抗原修復(fù)法
不銹鋼高壓鍋中加自來水加熱至沸騰，微波盒中加入修復(fù)液于微波爐中加熱至沸
騰，將切片放入微波盒中，再將微波盒放入高壓鍋中蓋上鍋蓋，待噴氣后計(jì)時(shí)
4~8 min 即可關(guān)閉熱源，自然冷卻至室溫后自來水沖洗，取出切片。此方法適用
于較難檢測或核抗原的修復(fù)。